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Cinética de fermentación de Lactobacillus plantarum en un medio de cultivo enriquecido como potencial probiótico*
ARTÍCULO DE
(Recibido: septiembre 23, 2013 Aprobado: noviembre 21, 2013 Actualizado: diciembre 20, 2013)
RESUMEN: El objetivo fue determinar la cinética de crecimiento de Lactobacillus plantarum en medio de cultivo enriquecido como potencial probiótico. Las cepas de L. plantarum 1 fueron probadas con el medio comercial MRS; y con 10 g/L azúcar blanco, 15 g/L leche de soya, 150 g/L suero de leche, 15 g/L salvado de trigo (Medio 4). Las variables evaluadas durante la cinética fueron: determinación de pH, viabilidad en placa (UFC/ml), determinación de azúcar total, determinación de la producción de ácidos orgánicos, y evaluación de la producción de biomasa. Los mejores resultados para viabilidad en el Medio 4 (M4) fueron para L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 con valores de 3,0 x 1012 y 6,0 x 1011 UFC/ml a las 12 horas de efectuada la cinética. La evolución de pH final fue de 4,21 y 4,07 respectivamente para cada cepa. El azúcar total y la producción de ácido láctico en el Medio 4 para L. plantarum 1 H1 presentó valores de 8,90 g/L y de 17,66 g/L respectivamente. Para L. plantarum 1 H2 presentó valores de 10,8 g/L y de 13,16 g/L respectivamente. Durante el proceso de fermentación efectuado, las dos cepas evaluadas alcanzaron los valores mayores de μh-1. Sin embargo, es de tener en cuenta que entre las dos bacterias la mejor μh-1 se presentó en L. plantarum 1 H1 y por tanto, el tiempo de duplicación celular es menor. L. plantarum 1 en el Medio 4 indicó ser óptimo como inóculo probiótico que podría ser evaluado en lechones como alternativa al uso de antibióticos.
Palabras clave: antibióticos, biomasa, inóculo, funcional
Fermentation kinetics of Lactobacillus plantarum at a rich culture medium as a potential probiotic
ABSTRACT: The objective to determine the kinetics of growth of Lactobacillus plantarum in culture medium enriched as potential probiotic. The strains of L. plantarum 1 were tested with MRS commercial medium, and 10 g/L white sugar, 15 g/L soy milk, 150 g/L whey, 15 g/L wheat bran (Medium 4). The variables were evaluated during the kinetics: determination of pH, plaque viability (CFU/ml), determination of total sugar, determination of organic acid production, and evaluation of biomass production. The best results for viability in the medium 4 (M4) were for L. plantarum 1 H1 and L. plantarum 1 H2 with values of 3.0 x 1012 and 6.0 x 1011 CFU/ml at 12 hours made the kinetics.The evolution of final pH was 4.21 and 4.07 respectively for each strain. The total sugar and lactic acid production in the medium 4 for L. plantarum 1 H1 showed values of 8.90 g/L and 17.66 g/L. For L. plantarum 1 H2 showed values of 10.8 g/L and 13.16 g/L respectively. During the fermentation process carried the two strains tested reach values greater than ofμh-1. However, it is of note that between the two bacteria the best μh-1 was introduced in L. plantarum 1 H1 and hence, the cell doubling time is lower. L. plantarum 1 on the medium 4 shown to be optimal as probiotic inoculums can be evaluated in piglets as an alternative to antibiotics.
Key words: antibiotics, inoculum, biomass, functional
Introducción
Los Lactobacillus tienen un metabolismo fermentativo, son principalmente aerotolerantes y otras especies son estrictamente anaeróbicas. El crecimiento se da a un pH de 4,5-5,8. Son exigentes en cuanto a aminoácidos, péptidos, nucleótidos, vitaminas, minerales, ácidos grasos y carbohidratos. Se clasifican en homolácticos y heterolácticos con base en la vía de fermentación que utilizan. En condiciones de exceso de glucosa y un limitado uso de oxígeno, los homolácticos transforman un mol de glucosa a través de la vía glucolítica de Embden-Meyerhof-Parnas para formar dos moles de piruvato. El balance redox intracelular se mantiene por la oxidación de NADH con la concomitante reducción del piruvato en ácido láctico. Este proceso genera dos moles de ATP por cada mol de glucosa consumida. Los representantes de las Bacterias Ácido Lácticas (BAL) homolácticas y heterolácticas incluyen Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus y el grupo I Lactobacilli (Axelsson, 2004). En la producción animal el género Lactobacillus, ha sido utilizado en lechones destetos para prevenir desordenes en el tracto gastrointestinal, como es el caso de la diarrea, promover el crecimiento, estimular la inmunidad protectora contra patógenos y aumentar la respuesta inmune de la mucosa intestinal. El objetivo de este trabajo fue determinar la cinética de crecimiento de Lactobacillus plantarum en medio de cultivo enriquecido como potencial probiótico.
Materiales y Métodos
El presente estudio se realizó en los laboratorios de Microbiología y en los laboratorios de Biocatálisis y Fermentación de la Escuela de Ingeniería de Alimentos de la Universidad del Valle, sede Meléndez, Cali, Colombia.
Inicialmente la reconstitución de la cepa se realizó utilizando un agar nutritivo (Nutrient Agar) marca OXOID CM0003 de 500 g, elaborado por OXOID LTD, Basingstoke, Hampshire, England, el cual se preparó de acuerdo a las instrucciones indicadas. Como paso siguiente, a las 24 horas se procedió a la reconstitución de la cepa de acuerdo a las instrucciones para Microorganismos KWIK-STIK™.
Posteriormente, se confirmó su crecimiento y se pasó a realizar el repique en cajas con agar MRS comercial, por el método de estrías y se incubó por 24 horas a 35°C. Este procedimiento se realizó en cámara de flujo laminar tipo II, para evitar contaminación del medio.
Al día siguiente, se revisó nuevamente su crecimiento en el agar MRS para constatar su morfología tanto macroscópica como microscópicamente y mediante tinción de Gram se confirmó su pureza. Para la conservación de la cepa se realizó cada cinco días en medio sólido en agar MRS y cada ochos días en caldo MRS, estos preservados se incubaron por 20-24 horas a 35-37°C y se almacenaron refrigerados en nevera a 4°C. Asimismo, cada vez que se realizó un nuevo repique o siembra se confirmó su pureza mediante tinción de Gram.
Posteriormente, se inoculó una alícuota de la cepa en un erlenmeyer que contenía 40 ml de caldo MRS comercial estéril. Se incubó por 24 h a 35°C. Nuevamente se realizó un repique de 4 ml de esta en caldo a otros 40 ml de caldo MRS comercial y se incubó en las condiciones antes mencionadas.
Según Crueger & Crueger (1993), el porcentaje de inóculo se debe ajustar al 10% v/v, para iniciar la fermentación. Para esto, se prepararon 90 ml de caldo MRS estéril y se adicionaron 10 ml del inóculo probiótico aplicando la regla. Después de este tiempo se calculó el número de bacterias por ml.
Del caldo MRS comercial con el inóculo se tomó 1 ml y se hizo lectura directa en espectrofotómetro a 625 nm, cuando se presentó mayor población de la establecida se adicionó caldo estéril teniendo en cuenta el siguiente cálculo matemático de proporcionalidad de acuerdo a Guerrero (apud Montes et al., 2003):
M1 = población o densidad celular que se debe ajustar
Enseguida, las cepas de L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 aisladas microbiológicamente del intestino grueso de cerdos fueron probadas con cuatro medios de cultivo seleccionados con la siguiente composición: Medio comercial MRS (Medio 1); 20 g/L azúcar blanco, 14 g/L leche de soya, 130 g/L suero de leche, 30 g/L salvado de trigo (Medio 2); 15 g/L azúcar blanco, 12 g/L leche de soya, 120 g/L suero de leche, 10 g/L salvado de trigo (Medio 3); 10 g/L azúcar blanco, 15 g/L leche de soya, 150 g/L suero de leche, 15 g/L salvado de trigo (Medio 4).
Estos medios fueron evaluados mediante cinéticas de fermentación (Ramírez, 2005) que se efectuaron en un erlenmeyer de 200 ml a 32°C, en agitación constante en shaker. Los parámetros evaluados fueron: evolución del pH, viabilidad en Unidades Formadoras de Colonia por mililitro (UFC/ml), consumo de azúcar y producción de ácidos orgánicos. Las mediciones o toma de muestras se realizaron cada tres horas durante 24 horas.
Se realizó comparando el Medio comercial (MRS) para el crecimiento de las Bacterias Ácido Lácticas (BAL) con los resultados obtenidos de células viables, pH y el costo de elaboración de un litro de este Medio comercial comparado con el costo de la materia prima para la producción de un litro de inóculo con el Medio 4.
Se verificó mediante la medición en pHmetro [Modelo digital Atronix 4801 (40HP), New York, USA]; indicando la producción de ácidos orgánicos cuantificados por HPLC y relacionados con el conteo de viabilidad.
El análisis de producción de ácidos orgánicos se realizó por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), permitiendo caracterizar las bacterias en homo o heterofermentativas, estableciendo un perfil característico para cada especie (Brizuela, 2003), descartando fácilmente cepas con perfiles idénticos. El caldo de crecimiento se centrifugó a 8500 rpm, filtrando el sobrenadante por membrana de 0,45 m. Los ácidos orgánicos fueron determinados por HPLC así: solvente de fase móvil, ácido sulfúrico a pH 1,5; presión 800-900 PSI; volumen inyectado: 20 L; temperatura del horno: 65ºC; columna BIORAD aminex HPX87 H con soporte de resina trasplantada H+ (copolímero de estireno y bisulfato dedivinilbenzeno).
El conteo de microorganismos viables en placa UFC/ml, permitió determinar la producción de biomasa. No se efectuaron medidas por peso seco ni por turbidimetría debido a las elevadas cantidades de sólidos en suspensión del medio de cultivo. Para los conteos se diluyó 1 ml de muestra en 9 ml de agua peptonada al 0,1% y se hicieron diluciones decimales; de cada dilución se transfirió a cajas de Petri con Medio MRS con azul de anilina 0,1 ml para siembra en superficie. Las cajas fueron incubadas a 32°C y observadas entre las 24 y 48 horas. Se consideraron las cajas de Petri con conteos de UFC/ml entre 30 y 300 colonias. El número de colonias fue multiplicado por el inverso de la dilución y por 10 para obtener las UFC/ml.
La determinación de azúcar total, permitió determinar el consumo para el crecimiento de los microorganismos y establecer la relación de consumo/crecimiento celular. Los azúcares fueron determinados por el método de Dubois et al. (1956), conocido por el método de antrona. Se preparó previamente una curva patrón con diferentes concentraciones de la solución patrón glucosa; los valores obtenidos de la lectura de densidad óptica (D.O.) a 525 nm. Se graficaron versus la concentración en mg/L y se obtuvo la ecuación de la recta.
La dosificación de los azúcares presentes en las muestras en estudio fue efectuado sobre 2,5 ml de muestra previamente diluida en agua destilada y adicionados 5 ml de antrona preparada en ácido sulfúrico. Los valores obtenidos de las muestras se calcularon por la ecuación de la recta, obtenidos en la curva patrón y multiplicados por el factor de dilución.
La evaluación de la síntesis de ácidos orgánicos se llevó a cabo siguiendo las mismas condiciones descritas anteriormente en el método de diferenciación de cepas por la producción de ácidos orgánicos.
Los resultados obtenidos de la evaluación de biomasa permitieron determinar las cepas que resultaron ser las más adecuadas en términos tiempo-tasa de crecimiento durante el proceso de fermentación para establecer el tiempo de duración en la producción de biomasa.
Los cálculos de fermentación para las cinéticas son los definidos por Crueger & Crueger (1993) y Rodríguez et al. (2004). La velocidad específica de crecimiento definida por la ecuación tiempo de duplicación celular. Siendo la velocidad específica de crecimiento definida por la ecuación:
V max = dln X / dt
Los datos se analizaron usando un diseño experimental con estructura factorial 2 x 2 en bloques completamente al azar, con la siguiente fórmula matemática:
Yijk = U + Ai + Bj + Cij + (ABij) + eij, donde:
La variable medida fue las UFC/ml. El análisis estadístico sobre la viabilidad obtenida de los microorganismos (UFC/ml) para L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 en dos medios distintos se hizo a lo largo de 5 estados de tiempo (tomados en un periodo de 24 horas), para observar mejor su crecimiento, de esta manera, los tiempos fueron tomados con intervalo de 6 horas. Las UFC/ml se trabajaron bajo transformación logarítmica.
Resultados y Discusión
En el estudio se presentaron los mejores resultados para la viabilidad en el Medio 4 (M4) para L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 con valores de 1,0 x 1013 y 4,0 x 1014 UFC/ml. La evolución de pH final fue de 3,75 y 3,70 respectivamente para cada cepa.
Estos resultados son mejores que los presentados en el Medio comercial MRS, en el cual L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 mostraron viabilidades de 1,0 x 108 y 4,0 x 1012 UFC/ml. De igual manera, los valores finales de pH fueron de 3,94 y 3,80.
Por lo anterior, se seleccionó el Medio 4 para los diferentes ensayos de cinética. El menor pH presentado para las dos cepas en el Medio 4 se debió probablemente a una mayor producción de ácido láctico durante el crecimiento, siendo esta una característica importante de L. plantarum (Zamudio & Zavaleta, 2003). La concentración celular alcanzada en el Medio 4 para los dos microorganismos, es considerada como óptima de 108 y 109 UFC/g (Kaban & Kaya, 2006), indicando ser adecuados en la preparación de inóculos con propiedades probióticas. Zamudio & Zavaleta (2003), afirman que entre los Lactobacillus que presentan buenas características como potenciales bacterias probióticas (resistencia a pH 3 y 0,3% de bilis), se encuentra el L. plantarum.
La prueba por HPLC indicó que las cepas de L. plantarum 1 H1 y H2 eran homofermentivas, presentando una producción de ácido láctico superior al 75% (Tabla 1), el cual podría contribuir a disminuir el pH del medio y actuar como inhibidor de microorganismos patógenos (Ramírez, 2005). El 25% restante se evidenció que correspondía a ácido cítrico, ácido succínico, ácido acético, glucosa y etanol. Tabla 1
L. plantarum 1 H1 en los medios M4 y MRS, presentó el máximo crecimiento (UFC/ml) a las 12 horas de la cinética, es decir, al alcanzar la fase exponencial de crecimiento, con valores de 3,0 x 1012 UFC/ml y de 2,0 x 1012 UFC/ml respectivamente, con una pequeña ventaja para el Medio 4. En el caso de L. plantarum 1 H2 en los medios 4 y MRS, obtuvo el máximo crecimiento (UFC/ml) a las 12 horas de la cinética, con unos valores de 6,0 x 1011 UFC/ml y de 6,0 x 109 UFC/ml respectivamente, con una ventaja para el Medio 4.
La Tabla 2, describe la viabilidad (UFC/ml) en los 2 medios de cultivos y las 2 bacterias usadas, evidenciando poca diferencia entre bacterias y entre medios de cultivo a lo largo del tiempo de crecimiento. Sin embargo, L. plantarum 1 H1 en el medio de cultivo 4 presentó en promedio un crecimiento mayor. Para el medio de cultivo 4, los resultados de UFC/ml presentan mayor variabilidad con respecto a la media producida por el efecto de las dos bacterias en este sustrato, es decir, la variabilidad presentada para el Medio 4 es superior al Medio MRS. Los dos microorganismos presentaron similar variabilidad con respecto al promedio generado para los dos medios de cultivo, pero se observa, que la bacteria que presenta mayor desarrollo de UFC/ml es L. plantarum 1 H1. Esto permite una eficiente colonización en la mucosa intestinal y la adhesión mediante la unión de manosa en células de la mucosa. Esta acción se explica por la fermentación de azúcares y fibras del sustrato (para esta investigación el Medio 4), preferido para enterocitos, los ácidos grasos de cadena corta. Esto es muy importante ya que gracias a este hecho, L. plantarum 1 contribuye a la exclusión de otras bacterias para adherirse, reduciendo la translocación y la inflamación intestinal; además, de estimular la producción de mucinas en las células HT-29 in vitro (Mack et al., 2003).
Mediante la cinética el tiempo requerido para obtener el máximo crecimiento microbiano en los medios 4 y MRS fue de 12 horas, coincidiendo con los encontrados por Ramírez (2005), quien obtuvo mayor crecimiento con L. plantarum, con 12 horas de proceso y en un medio igual a la del Medio 4 utilizado en esta investigación, y con un incremento celular de 9,6 x 1011 UFC/ml y 8,2 x 1011 UFC/ml respectivamente, señalando que el tiempo mínimo de duración del proceso fermentativo con utilización de estos medios fue de 12 horas. De igual manera, esta autora encontró que el medio MRS presentó una leve desventaja comparada con el medio 4. Tabla 2
El tiempo sí influye en el proceso de crecimiento (UFC/ml), lo que lleva a tener en cuenta los efectos que se puedan generar de la interacción entre las bacterias y el medio de cultivo. Es posible que al controlar el efecto producido por el tiempo, el error experimental dentro de los tratamientos disminuya y permita una mejor comparación estadística entre los tratamientos (Tablas 3 y 4). Tabla 3-4
Se observa que no se presentaron diferencias estadísticamente significativas (p>0,05) entre el efecto de la interacción entre el medio de cultivo y las bacterias.
Dado que la interacción entre el medio de cultivo y las bacterias no es significativa, se evaluó cada factor por separado, donde el factor bacteria presentó diferencias estadísticamente significativas (p<0,05), mientras que el factor medio de cultivo no las presentó (p>0,05).
La evolución del pH en los medios 4 y MRS para L. plantarum 1 H1 presentó valores de 4,21 y 4,19 respectivamente a las 12 horas de efectuada la cinética. Para el caso de L. plantarum 1 H2 presentaron valores de 4,07 y 4,13 respectivamente. Para estos valores no presentó diferencias estadísticamente significativas (p>0,05).
El azúcar total en los medios 4 y MRS para L. plantarum 1 H1 presentó valores de 8,90 g/L y 6,41 g/L respectivamente a las 12 horas de efectuada la cinética. Para el caso de L. plantarum 1 H2 en los medios 4 y MRS presentó valores de 10,8 g/L y 4,07 g/L respectivamente. El sustrato del Medio 4 es usado de manera más eficiente en el crecimiento, que el MRS, por L. plantarum 1 H1 y H2, teniendo en cuenta que las concentraciones iniciales fueron iguales (15,1 g/L).
La producción de ácido láctico en los medios 4 y MRS para L. plantarum 1 H1 presentó valores de 17,66 g/L y 16,13 g/L respectivamente a las 12 horas de efectuada la cinética. Para el caso de L. plantarum 1 H2 presentó valores de 13,16 g/L y 17,09 g/L respectivamente (Tablas 5 y 6).
Esta alta viabilidad presentada por L. plantarum 1 y sus altas concentraciones de microorganismos (>107 UFC/g) (Vargas et al., 2004), serán un factor decisivo para que estos microorganismos realicen la colonización del tracto gastrointestinal en los lechones destetos contribuyendo a mejorar los recuentos de Lactobacillus en el tracto intestinal en experimentos in vivo (Gardiner et al., 2004). Tabla 5-6
Los resultados de la producción de consumo de azúcar total (g/L) y de biomasa aparecen en las Figuras 1 y 2, y en la Tabla 7.
La tasa de rendimiento en el Medio 4 no fue calculada, por cuanto no fue posible la obtención real del peso seco de la biomasa, por la elevada cantidad de sólidos en suspensión. Estos sólidos son responsables por el incremento de la producción de biomasa viable en este medio, y esto se da por la mayor superficie de contacto que brindan para las bacterias. Este aspecto sería una razón importante para la investigación de los procesos relacionados con la producción de biomasa y para la elaboración de inóculos con propiedades probióticas.
Los productos para que sean considerados como probióticos, dependen de la legislación de cada país. Algunos señalan que deben contar con una población mínima de 106 UFC/ml, y otros señalan que debe tener la cantidad necesaria para que se ingiera una cantidad de 109 UFC/ml (Ouwehand et al., 2002). Sin embargo, para poder sostener los beneficios en la salud, la bacteria probiótica debe estar viable y disponible a altas concentraciones, por lo general, >106 UFC/g de producto (Puupponen-Pimiä et al., 2002). Así por ejemplo, aunque los sustratos favorecen de manera distinta a los microorganismos, se obtienen conteos por encima del criterio identificado para la industria láctea (1,0 x 106 UFC/ml). Teniendo en cuenta lo anterior, se pueden considerar los alimentos desarrollados como probióticos (FAO, 2010).
Los valores de pH encontrados a las 12 horas de cinética indican que L. plantarum 1 favorece los procesos de fermentación en la producción de inóculos. Este pH alcanzado en el Medio 4 y que corresponde al pH del medio intestinal de los lechones, es debido muy probablemente a que son bacterias aisladas del intestino de cerdos y que harían que se adapten más fácilmente en el tracto gastrointestinal debido a la especificidad del hospedero (Prescott et al., 2002).
Con estos valores de pH las bacterias probióticas aisladas podrán sobrevivir al tránsito a través del estómago, en donde la secreción de ácido gástrico constituye un mecanismo de defensa primario contra la mayoría de los microorganismos. Por consiguiente, L. plantarum se considera un probiótico único, por su capacidad de soportar valores de pH más bajos que la mayoría de otros microorganismos y por esta razón es común encontrarlo en alimentos fermentados naturalmente (Cebezi & Gürakan, 2003). Esta capacidad de resistir estas condiciones de acidez, se da por mecanismos celulares (como bombas de extracción de protones) para mantener el pH intracelular próximo a la neutralidad; siendo el L. plantarum 1 una de las cepas de mayor capacidad y uso probiótico (Cebezi & Gürakan, 2003).
Teniendo en cuenta que L. plantarum pertenece a la misma familia de Lactobacillus que se encuentran en el intestino de los lechones, se podrían obtener buenos resultados al alimentar los lechones a partir del destete con los probióticos seleccionados que incluyan estas especies de bacterias lácticas, y así, se podrá mantener un pH ácido, que puede determinar un fenómeno de inhibición microbiana a lo largo del tracto intestinal, previniendo un desorden gastrointestinal (Iñiguez et al., 2007).
Estos resultados indican que estos microorganismos son óptimos para ser utilizados en la preparación de inóculos, por cuanto a las 12 horas de la cinética, en el cual las dos bacterias alcanzan la fase exponencial de crecimiento, disponen de una concentración suficiente para mantener esta fase logarítmica, es decir, mantener una viabilidad alta en el tiempo. Según Ben et al. (2008), el Lactobacillus plantarum puede utilizar oligosacáridos como estaquiosa y rafinosa durante la fermentación. La leche de soya es una buena fuente de sacarosa, rafinosa y estaquiosa, así como de proteínas y magnesio. Durante la fermentación, más del 60% del contenido inicial de estaquiosa, rafinosa y sacarosa en la leche de soya se metaboliza por las bacterias y para el caso de Lactobacillus plantarum estos investigadores obtuvieron viabilidades de 1,0 x 109 UFC/ml al final de las fermentaciones.
Esta capacidad parece estar en parte vinculada a la síntesis de enzima α-galactosidasa que podría hidrolizar α-galactósidos (estaquiosa y rafinosa) durante la fermentación (Connes et al., 2004). Esto confirma los resultados obtenidos en esta investigación, según los cuales, L. plantarum 1 crece adecuadamente en medios (como el Medio 4) cuya composición tiene leche de soya (Nguyen et al., 2003; Pyo et al., 2005). Los probióticos deben ser viables en el alimento en concentraciones de 106-1011 UFC/ml, durante el tiempo de vida útil, coincidiendo con los resultados encontrados en el estudio de cinética (Collado et al., 2007).
En general, para que L. plantarum 1 se implante y colonice los enterocitos, es indispensable que disponga de una dieta rica en sustratos prebióticos, algunos de estos son de naturaleza lignocelulósica (oligosacáridos, fructooligosacáridos, fibra, cereales), derivados de la lactosa (galactooligosacáridos, lactulosa, lactitol), inulina, entre otros, coincidiendo con el prebiótico salvado de trigo (fibra insoluble) utilizado en esta investigación (Bielecka et al., 2002; Holzapfel & Schillinger, 2002).
Esta versatilidad de Lactobacillus plantarum se debe al tamaño de su genoma, el cual es 50% más grande que la mayoría de BAL y tiene una gran capacidad metabólica, que le permite utilizar una gran variedad de fuentes de carbono; propiedad que resulta de un gran número de genes involucrados en el transporte y utilización de azúcar, y un versátil metabolismo del piruvato, el cual tiene el potencial de producir D y L-lactato, formato, acetato, etanol, acetoína y 2,3-butanediol (Ljungh & Wadstrom, 2009).
Una característica importante del género Lactobacillus es su capacidad de producir ácido láctico y que tiene una influencia directa en el descenso de pH presentado en el Medio 4 (M4) y MRS. Esta producción de ácido láctico se da a partir de la fermentación de las hexosas a ácido láctico por la vía Embden-Meyerhof, o bien ciertas bacterias, con producción de ácido láctico, ácido acético, etanol y ácido fórmico. Esta fermentación también se puede dar a partir de las pentosas hasta ácido láctico y ácido acético por la vía de fosfocetolasa inducible. Entre estos microorganismos está L. plantarum (Llanes et al., 2007).
Uno de los más importantes mecanismos por el cual las BAL inhiben a sus competidores se da por la producción de ácido láctico, acético y bacteriocinas. La producción de ácido láctico por parte de L. plantarum 1 es un factor importante debido a que los lechones destetos presentan una inadecuada capacidad para la acidificación. La producción de ácido láctico y acético posee un efecto inhibitorio y esto se relaciona con la estructura no disociada de la molécula, siendo esta capaz de difundirse a través de la membrana celular y disociarse en su interior para provocar la muerte de la bacteria patógena. De esta manera, a los dos días de destetados los lechones gran número de coliformes proliferan en el tracto intestinal y está fuertemente correlacionado al aumento del pH del contenido ileal, al tiempo que los Lactobacillus están reducidos debido a la colonización y proliferación de E. coli por un posible bloqueo de sus receptores intestinales y secreción de tóxicos metabólicos. Es así, como, el cerdo lactante emplea muchas formas para vencer la limitación de la insuficiente secreción ácida; la primera estrategia implica la conversión de lactosa de la leche de la madre a ácido láctico por los Lactobacillus que se encuentran en el estómago; la segunda, el cerdo lactante reduce la necesidad de la secreción de grandes cantidades de ácido transitoriamente por la ingestión frecuente de pequeñas cantidades de alimento (Iñiguez et al., 2007).
La producción de ácido láctico se dio a una temperatura de 32°C y con buenos valores a las 12 horas, y Orozco y Solarte (2003) sostienen que a 30°C es una temperatura óptima, usando pentosas como sustrato, presentando la producción de ácido láctico racémico. Esta producción se incrementa simultáneamente al consumo de azúcares, dándose hasta el agotamiento del azúcar en el medio, incluso luego del crecimiento celular se continúa produciendo este metabolito. Según lo anterior, se puede clasificar la fermentación como in batch tipo I, pues la formación de ácido láctico deriva directamente del metabolismo primario utilizado para la producción de energía (Zhan et al., 2007).
El Medio 4 (M4), resultó ser el más adecuado para la elaboración de los inóculos, ya que durante el proceso de fermentación efectuado las dos cepas evaluadas alcanzaron los valores mayores de μh-1. Sin embargo, entre las dos bacterias la mejor μh-1 fue para L. plantarum 1 H1 y por tanto, el tiempo de duplicación celular es menor, lo que se ve reflejado en una mayor concentración celular en la fase logarítmica a las 12 horas. Se evidencia una clara diferencia con respecto al Medio MRS, por cuanto, en este medio los valores de μh-1 fueron inferiores para los dos microorganismos y con diferencia significativa para L. plantarum 1 H2 que mostró un valor de 0,2875 (μh-1), lo que indica que usar este Medio comercial para elaborar los inóculos no sería viable debido a que presentaría un tiempo de duplicación celular muy elevado, lo que implica que al llegar a la fase logarítmica la concentración celular será mucho menor, con respecto al Medio 4. Además, confirmaría que son 2 cepas diferentes y que L. plantarum 1 H1 tendría una mejor capacidad metabólica para utilizar este sustrato (M4 y MRS). En cuanto a que L. plantarum H2 sería más exigente referente al sustrato ya que necesitaría de una mayor fuente de carbohidratos como los proporcionados por la leche de soya, como lo son la rafinosa y la estaquiosa.
Por otro lado, los costos de producción del Medio 4 (M4) y MRS, son de gran interés por cuanto es factible el proceso de producción a nivel industrial de estos inóculos para estos microorganismos. De esta manera, el costo de 500 gramos del Medio comercial MRS es aproximadamente de US$ 170,44, y el costo de elaboración de un litro de este Medio comercial es de US$ 19,88; mientras, que el costo de la materia prima para la producción de un litro de inóculo con el Medio 4 fue de US$ 0,84.
En conclusión, Lactobacillus plantarum 1 mostró en el Medio 4 (10 g/L azúcar blanco, 15 g/L leche de soya, 150 g/L suero de leche, 15 g/L salvado de trigo) ser adecuado para la elaboración de inóculos con características probióticas que podrían ser utilizados en estudios posteriores para mejorar la salud y producción al ser incluidos en la alimentación para los lechones destetos.
Agradecimientos
A la empresa CERVALLE por la financiación de este proyecto de investigación. A la Escuela de Ingeniería de Alimentos de la Universidad del Valle; al Dr. Germán Bolívar. A todas las personas que de una u otra manera colaboraron en esta investigación.
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Efecto de uso del suelo bajo un sistema silvopastoril estrella (Cynodon plectostachyus) y leucaena (Leucaena leucocephala) sobre las simbiosis (Rhizobium, Micorrizas)
ARTÍCULO DE
(Recibido: julio 15, 2013 Aprobado: agosto 09, 2013 Actualizado: diciembre 20, 2013)
RESUMEN: Se evaluó el efecto de la asociación Leucaena leucocephala - Cynodon plectostachyus de 13 años de establecida, sobre la efectividad en la nodulación de Rhizobium en leucaena y su asociación con micorrizas. La pradera se estableció en la granja Montelindo; ubicada a 75°45’ longitud oeste y 5°04’ latitud norte (Palestina, Caldas) a 1050 m y 24C°. La evaluación del Rhizobium se determinó de acuerdo con cantidad, color y diámetro de nódulos fijadores de nitrógeno; para las micorrizas se realizó la tinción de raíces para la identificación de esporas efectuando su comparación con la base de datos INVAM (International Culture Collection of VA Mycorrhizal Fungi). La pradera a evaluar consta de 4 lotes de 1 ha (4 franjas por lote en una rotación 10/30); las muestras se tomaron entre 0 y 4, 4 y 8, 8 y 12, 12 y 16, 16 y 20 cm con un barreno sección redonda de acero inoxidable de 3”. Se identificaron en todas las profundidades analizadas la presencia de nódulos fijadores (cantidad, color y diámetro) sin encontrarse diferencias significativas (p>0,05) a las cinco profundidades evaluadas, excepción para diámetro entre 12 y 16 cm de profundidad, el cual fue altamente significativo (p≤0,01). Para micorrizas se encontró presencia del genero Glomus a las cinco profundidades. Se concluyo que en los 13 años de la asociación, se conserva la calidad del suelo mediante la asociación, dada la alta efectividad de la nodulación, presencia de micorrizas y la gran tasa de crecimiento, vigor y capacidad de recuperación de la leucaena.
Palabras clave: bacterias nitrificantes, micorrizas, microbiología de suelos
Effects of soil use under an AficanStar (Cynodonplectostachyus) system andleucaena(Leucaenaleucocephala) trees on the (Rhizobium, Mycorrhiza)symbiosis
ABSTRACT: The 13 years established association Leucaena leucocephala- Cynodon plectostachyus effect on the Rhizobium on leucaena nodulation effective ness and its association whit mycorrhizal was evaluated. The grassland was established in the Montelindo farm located at 75°45’ west and 5°04’ North (Palestina, Caldas) at 1,050 m and 24C°. The evaluation of Rhizobium was determined according to amount, color and diameter of nitrogen fixing nodules; for mycorrhizalthe staining of the roots was performed for identification of spores through a comparison with the IMVAM (International Culture Collection of VA Mycorrhizal Fungi) database. The grassland to be evaluated was divided into 4 plots of 1ha each (4 strips per plotin a 10/30rotation); the samples were taken from 0 to 4, 4 to 8, 8 to 12, 12 to 16, 16 to 20 cm with a 3 inches stainless steel bore. The presence of nitrogen-fixing nodules (number, color and diameter) was identified at all depths tested without significant differences (p>0.05) to the five different depths, except for the diameter between 12 to 16 cm deep which was highly significant (p≤0.01). The presence of the genus Glomus was found formycorrhizae at the five depths. It was concluded that in the 13 years of the association, the quality of the soil is preserved the association because of the high effective ness of nodulation, the mycorrhizal presence and the high rate of growth, vigor and recovery capacity of leucaena.
Key words: nitrifying bacteria, mycorrhizae, microbiology,mycorrhizas
Introducción
La intensificación de la producción agropecuaria ha ido acompañada de un gran aumento de la fertilización con nitrógeno (N) y fósforo (P) a nivel mundial; los cultivos absorben los nutrientes de los fertilizantes de manera limitada, la mayoría del N se pierde por lixiviación y volatilización y el P se pierde por fijación; Matson et al. (1997) estiman que alrededor del 40 al 60% del N que se aplica a los cultivos queda en los suelos o se pierde por lixiviación. La lixiviación de nitratos del suelo a los sistemas de abastecimiento de agua produce un aumento de su concentración en el agua y la contaminación de los sistemas de abastecimientos superficiales y subterráneos, lo cual se convierte en una amenaza para la salud humana y para los ecosistemas naturales.
El plan 2019 de FEDEGAN (Federación Colombiana de Ganaderos, 2006), propone aumentar la productividad en la ganadería bovina a través de alternativas eficientes de producción, en la mitad del área que actualmente ocupa la ganadería. Una buena opción tecnológica para la ganadería colombiana son las asociaciones gramíneas-leguminosas, ya que al ser las leguminosas fijadoras de N brindan a las gramíneas un aporte mayor de este y aumentan su productividad (Cardona, 1995; Cardona & Suárez, 1997).
Por las razones expuestas, el desarrollo pecuario en América tropical debe estar orientado a incrementar la producción bovina a una tasa que le permita cubrir la demanda de alimentos para una población que crece aceleradamente, rehabilitar las pasturas degradadas, prevenir el deterioro de los recursos naturales y asegurar que los productores locales puedan competir con ventaja ante la apertura de mercados (Ibrahim et al., 2000).
Se estima que la Leucaena leucocephala, inoculada con Rhizobium, aumenta la productividad de la gramínea asociada; puesto que ella contribuye con el 60 a 80% de la fijación biológica de N, permitiendo que la asociación crezca sin fertilizantes nitrogenados y sin empobrecer los suelos (Cuadrado et al., 2009). En una investigación realizada en Venezuela por Camacaro et al. (2004), se encontró que la densidad de leucaena es importante para la fijación de N, sin embargo, no se hallaron diferencias significativas entre 4000 y 8000 árboles/ha, pero al evaluar las parcelas donde se aplicó N químico, la producción de biomasa en la gramínea fue similar a la cual se le aplicó de 400-800 kg/N/ha/año.
Adicionalmente a los Rhizobium, existen otros organismos simbióticos en el suelo como las micorrizas (hongos mutualistas), que establecen asociaciones entre raíces de plantas superiores y el suelo; estos hongos dependen de la planta para el suministro de carbono, energía y un nicho ecológico, a la vez entregan nutrimentos minerales a las plantas (especialmente los poco móviles como el P, por estar acomplejado por el Ca, el Fe y el Al, especialmente en suelos ácidos); así mismo imparten otros beneficios como: sustancias reguladoras de crecimiento, incremento de la tasa fotosintética, ajuste osmótico cuando hay sequía, aumento de la fijación de N por bacterias simbióticas o asociativas, resistencia a plagas y enfermedades, mejoras a la agregación del suelo y mediación en muchas de las acciones de interacciones de la microflora y microfauna, que ocurren en el suelo alrededor de las raíces (Bethlenfalvay & Linderman, 1992; Sánchez, 1999).
El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto del uso del suelo utilizado, bajo un sistema silvopastoril (Cynodon plectostachyus - Leucaena leucocephala) después de 13 años de establecido, sobre la nodulación por Rhizobium y la presencia de micorrizas.
Materiales y Métodos
El experimento se realizó en la granja Montelindo de la Universidad de Caldas, ubicada a 75°45’ longitud oeste y 5°04’ latitud norte (Palestina, Caldas) a 1050 m y 24ºC de temperatura media. Las muestras recolectadas se procesaron en los laboratorios del Instituto de Biotecnología Agropecuaria de la Universidad de Caldas, en Manizales. En campo se utilizó una pradera establecida en 1999 de 4 ha (16 franjas de 2500 m2) dividido en 4 lotes experimentales de 1 ha (4 franjas por lote en una rotación 10/30); uno en monocultivo de Cynodon plectostachyus y tres en asociación (Leucaena leucocephala - Cynodon plectostachyus) con una densidad inicial de 10000 árboles/ha. Desde finales de 1999 estos lotes han sido sometidos a pastoreo directo en ramoneo, con bovinos comerciales tipo carne, con una carga equivalente por año entre 1750 a 2000 kg de peso vivo. Al momento de la siembra se aplicaron al suelo 200 kg/ha de roca fosfórica, además las semillas de leucaena fueron inoculadas con Rhizobium específico (cepa 4872 CIAT) y la micorriza se aplicó 30 g/árbol a los 45 días de la siembra, al momento de trasplantarlos al lote. Durante los 13 años de pastoreo se han aplicado 4 ton de gallinaza/ha al voleo a intervalos de 3 años.
El muestreo para la determinación de Rhizobium y micorriza se realizó solo en los tres lotes asociados (12 franjas de 2500 m2), donde se seleccionaron aleatoriamente cuatro plantas de leucaena (L. leucocephala) por franja a muestrear (12 muestras a 5 profundidades).
La metodología utilizada para la determinación de Rhizobium fue la propuesta por Bradley & Nolt (1988), que consiste en realizar perforaciones al suelo con la ayuda de un barreno de acero inoxidable sección redonda (3” de diámetro), el cual es introducido a golpe de martillo, separado a 10 cm del fuste de la planta. El barreno posee varias aberturas laterales, las cuales indican cinco profundidades: 0, 4, 8, 12, 16 y 20 cm (Figura 1).
Las muestras de suelo tomadas a las cinco profundidades fueron guardadas en bolsas plásticas debidamente rotuladas para su posterior análisis en el laboratorio; ellas fueron evaluadas tomando en cuenta características como: cantidad de nódulos presente en cada profundidad, diámetro del nódulo y color interno (Figura 2).
La evaluación del color interno del nódulo se realizó a través de un corte transversal; tonalidades rojizas determinan fijación de N activa; tonalidades blancas representan actividad no funcional, los nódulos rotos o vacíos no fueron tomados en cuenta.
Para la determinación de micorrizas se utilizó la técnica de tinción propuesta por Grace & Stribley (1991); el principio de esta técnica consiste en el aclaramiento del citoplasma y núcleo de las células de la raíz con una solución de KOH al 10%, y luego acidificarlas con HCl al 10%, para su posterior tinción. La técnica clásica de tinción con azul de tripano, se reemplazó por azul de metileno, y se modificó el tiempo de tinción, lo cual no afectó los resultados (Tabla 1).
Posterior a la tinción, las muestras fueron montadas en láminas portaobjetos para su observación en un microscopio utilizando un aumento de 40x.
Los resultados experimentales fueron analizados utilizando el paquete estadístico STATA® V 2012.
Resultados y Discusión
Para el caso de los nódulos (Rhizobium), no se encontraron diferencias significativas (p>0,05) entre las cinco profundidades estudiadas, tanto para la cantidad, como para el color; sin embargo, al analizar las diferentes profundidades en los tres lotes bajo sistema silvopastoril, se visualizaron algunas tendencias, como se observa en la Tabla 2.
Estas escalas de colores y diámetro se registraron con base en la metodología propuesta por Bradley & Nolt (1988), como se pueden observar en la Figura 3.
La efectividad en la fijación de nitrógeno se expresa en el color del nódulo ya que los de coloración de rosada, roja o marrón indican actividad en la fijación de nitrógeno molecular, en tanto que los de color blanco son inefectivos. Por tanto a las diferentes profundidades evaluadas se observó la mayor actividad del Rhizobium entre 12 a 16 cm, seguidas por las profundidades de 4 a 8 y 8 a 16 cm, respectivamente
En el análisis estadístico en la determinación del diámetro del nódulo, se encontró una diferencia altamente significativa (p≤0,01) entre los 12 y 16 cm, respecto a las demás profundidades analizadas. Lo anterior concuerda con investigaciones realizadas por Sánchez & Urdaneta (1997), quienes encontraron abundante nodulación hasta 1,5 m de profundidad y el tamaño predominante fue de 1 a 1,9 mm.
En todas las muestras analizadas a las cinco profundidades, se encontró presencia de micorrizas en las raíces secundarias (Tabla 3), estas se identificaron como esporas del género Glomus, con densidad entre 60 y 85 esporas por 50 g de suelo, indicando la efectividad de la simbiosis. Este resultado concuerda con los trabajos expuestos por autores como Rey et al. (2005), Flores et al. (2008), quienes encontraron que especies del género Glomus son las que expresan mejor la simbiosis en leucaena, aunque ellos reportan entre 66 y 104 esporas por gramo de suelo a 120 días de inoculación en condiciones de vivero; por tanto, se considera que la actividad de las micorrizas en campo es muy buena y efectiva (Figura 4).
Conclusiones
Al cabo de 13 años de establecida la asociación, se ha mantenido la misma carga animal (1750 a 2000 kg/ha), con excelentes ganancias de peso en los animales (4,5 kg/ha/día vs 3,0 kg/ha/día en monocultivo), lo cual lleva a concluir que el sistema silvopastoril leucaena-pasto estrella mantiene activas la simbiosis con Rhizobium y micorrizas y reiteran la conservación de la calidad y capacidad productiva de los suelos, gracias a la asociación leguminosa gramínea.
Se ratifica que estos dos microorganismos del suelo son grandes aportantes de nutrientes para el suelo y la planta, con una alta efectividad sobre la estabilidad de la pastura y su aprovechamiento por parte del animal en pastoreo.
Agradecimientos
A la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados de la Universidad de Caldas y al Instituto de Biotecnología Agropecuaria por el apoyo financiero del proyecto código 0613712.
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Desarrollo de una prueba de Western Blot para la detección de Brucella canis en perros1
ARTÍCULO DE
(Recibido: Abril 2 de 2014 Aprobado: Junio 20 de 2014 Actualizado: 19 Noviembre de 2014)
RESUMEN: La brucelosis canina es una enfermedad zoonótica causada por Brucella canis que afecta el sistema reproductivo de los caninos. La infección se disemina rápidamente en criaderos, por la presencia de individuos asintomáticos. Los métodos diagnóstico más utilizados son el hemocultivo y la prueba serológica 2ME-PARP, sin embargo presentan problemas de sensibilidad y especificidad por lo cual una prueba de Western Blot podría servir como complemento para obtener un diagnóstico certero de esta infección. El objetivo de este trabajo fue desarrollar una prueba de Western Blot para la detección de B. canis en perros. Se usaron proteínas de dos cepas de B. canis: M- y Brucella canis cepa Oliveri. Se utilizaron sueros de caninos de criaderos del Área Metropolitana del Valle de Aburrá, de la seroteca del grupo Biogénesis-Vericel, los cuales se clasificaron en 4 grupos según los resultados de las pruebas 2ME-PARP y hemocultivo. Se realizó SDS-Page al 12% y Western Blot, utilizando como anticuerpo primario una mezcla de 4 sueros de cada grupo a una dilución de 1:500 y como anticuerpo secundario anti IgG canino conjugado con peroxidasa dilución 1:6000. Posteriormente se analizó el peso de las bandas y se estableció un perfil de bandas inmunorreactivas para cada grupo. Se observaron diferencias en las bandas inmunorreactivas de acuerdo al grupo analizado. En el grupo 2 (2ME-PARP y hemocultivo positivos) se observaron bandas inmunorreactivas de aproximadamente 70, 55, 48 y 40 kDa. En el grupo 3 (2ME-PARP positivo, hemocultivo negativo) bandas de aproximadamente 55 y 40 kDa. En el grupo 4 (2ME-PARP negativo y hemocultivo positivo) bandas de 20, 18 y 12 kDa. Esta prueba de Western Blot, permite diferenciar caninos infectados de no infectados por los perfiles de bandas encontrados para cada grupo.
Palabras clave: Inmunorreactividad, anticuerpos, diagnóstico, caninos
Development of a Western Blot test for detection of Brucella canis in dogs
ABSTRACT: Canine Brucellosis is a zoonotic disease caused by Brucella canis that affects canines’ reproductive system . The infection spreads rapidly in breeding kennels because of the presence of asymptomatic individuals. The most commonly used diagnostic methods are the blood culture and the 2ME-RSAT serological test. However, they show problems of sensitivity and specificity, so a Western Blot test could serve as a complement to obtain an accurate diagnosis of this infection. The aim of this work was to develop a Western Blot test for the detection of B. canis in dogs. Proteins of two strains of B. canis were used; M- and Brucella canis Oliveri strain. Sera from kennel dogs from the metropolitan area of the Aburrá Valley from the serum bank of the Biogenesis research group which were classified into 4 groups according to the 2ME-RSAT tests results and blood culture were used. SDS-Page was carried out at 12% and Western blot, using as primary antibody a mixture of 4 sera from each group at a 1:500 dilution, and as secondary antibody anti canine IgG peroxidase conjugate 1:6000 dilution, was used. Then the weight of the bands was analyzed and an immunoreactive band for each group was established. Differences in the immunoreactive bands for each analyzed group were observed. In group 2 (2ME-RSAT and positive blood culture) immunoreactive bands of approximately 70, 55, 48 and 40 kDa were observed. In group 3 (2ME-RSAT positive, blood culture negative) bands of approximately 55 and 40 kDa were observed. In group 4 (2ME-RSAT negative and blood culture positive) bands of 20, 18 and 12 kDa were observed. This Western Blot test allows to differentiate infected from uninfected dogs because of the ban profile for each group.
Key words: Inmunoreactivity, antibodies, diagnosis, canines
Introducción
La brucelosis canina es una enfermedad zoonótica causada por la bacteria Brucella canis, que es un cocobacilo Gram negativo (Carmichael, 1966) de gran capacidad infectiva, que se ubica en los sistemas reproductivos de los perros sexualmente maduros, provocando en hembras placentitis seguido de aborto (generalmente en el último tercio de la gestación); induce atrofia testicular, epididimitis y orquitis en machos (Carmichael, 1996) y puede provocar esterilidad en ambos sexos (Rovid et al., 2010). La infección en un criadero se introduce por el contacto con animales infectados, dado que esta bacteria se encuentra en los fluidos vaginales de las perras, también se localiza en los tejidos y fluidos asociados al embarazo, leche (Olivera et al., 2011), semen, por la contaminación de la piel erosionada y las superficies de las mucosas de los perros (Rovid et al., 2010); los animales al estar confinados son más susceptibles a contraer la bacteria, provocando así una rápida propagación (Rovid et al., 2010).
También se pueden presentar casos de caninos portadores, pero que no presentan síntomas, siendo estos especímenes los más peligrosos ya que pueden expandir la enfermedad en el entorno en el que se localizan (Lucero et al., 2005).
B. canis se puede transmitir también a los humanos a través del contacto directo con secreciones de animales infectados (Olivera & Di-Lorenzo, 2009) y accidentes de laboratorio (Lucero et al., 2010); debido a las manifestaciones variables que presenta la enfermedad y a la falta de signos físicos, se dificulta el diagnóstico en humanos (Jacob et al., 2008); es una enfermedad multisistémica, siendo el sistema óseo el más frecuentemente afectado (Lucero et al., 2007).
Los métodos más usados para el diagnóstico de B. canis en caninos son la prueba de aglutinación rápida en placa con 2-mercaptoetanol (2ME-PARP), que es una prueba serológica tamiz (Carmichael, 1987) y el hemocultivo que es la prueba de oro. Otras pruebas serológicas como las pruebas de ELISA y Western Blot, se han desarrollado en algunos países como Argentina (Lucero et al., 2002) y Brasil (Daltro de Oliveira et al., 2011) pero sus resultados no se han extrapolado a otros países.
El diagnóstico de esta infección es difícil debido a que las pruebas serológicas utilizadas pueden presentar resultados variables en cuanto a su sensibilidad y especificidad dependiendo del estadio de la infección del perro, ya que en los casos agudos aún con hemocultivo positivo, puede no detectarse la presencia de anticuerpos. En los casos crónicos, la prueba serológica puede ser positiva con hemocultivos negativos, pues la bacteria no está en circulación sino focalizada en algún órgano del sistema linfoide (Wanke, 2004). El diagnóstico depende entonces de la confirmación de la presencia de la infección de la bacteria, ya sea por aislamiento bacteriológico (MacPhee, 2010), detección de anticuerpos o de material genético bacteriano en sangre o en otros fluidos como leche (Olivera et al., 2011) por técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
El problema principal del diagnóstico serológico, es que se pueden presentar resultados variables en estas pruebas, ya que un canino puede ser seronegativo incluso con hemocultivo positivo o pueden ser serológicamente positivos con hemocultivo negativo (Castrillón-Salazar et al., 2013). Estas diferencias en el resultado de la prueba 2ME-PARP, generan dudas sobre los resultados, ya que no siempre se puede realizar confirmación de la infección con hemocultivo, por lo cual se sugiere repetir las pruebas serológicas cada determinado tiempo para llegar a una conclusión definitiva sobre el diagnóstico del canino. Una alternativa a este problema sería contar con otra prueba serológica más específica como el Western Blot, ya que la unión antígeno-anticuerpo permite detectar proteínas inmunorreactivas específicas, por lo cual sería una herramienta adicional para la toma de decisiones en cuanto al diagnóstico de esta infección.
Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue desarrollar una prueba de Western Blot utilizando la cepa B. canis M- (Carmichael, 1996) y una cepa de campo aislada y secuenciada completamente: B. canis str. Oliveri (número de acceso HG803175.1 y HG803176.1). Para determinar la sensibilidad y especificidad de la técnica se comparó la especificidad del extracto proteico total de B. canis de cada una de las dos cepas mencionadas frente a varios grupos de sueros de caninos con diferentes características.
Materiales y Métodos
Extracción de proteínas: Se probaron cinco métodos de extracción de proteínas y se cuantificaron para determinar cuál fue el mejor. Los cinco métodos se describen brevemente a continuación:
Protocolo 1 (Daltro de Oliveira et al., 2011): Se realizaron cultivos de cada una de las dos cepas de B. canis en TSA (tripticasa soya agar) a partir de leche descremada, los agares se incubaron a 37°C por 48 h.
Posteriormente, se sembraron los cultivos en tubos de 5 ml de TSC (tripticasa soya caldo) y se incubaron a 37°C por 48 h; se expandió el cultivo en 3 botellas con 100 ml de TSA cada una y se incubaron a 37°C por 48 h. Se recolectaron de cada botella las bacterias con 50 ml de PBS estéril (buffer fosfato salino; 150 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 9 mM Na2HPO4, pH 7,4), se inactivaron por calor 1 h a 56°C, se filtró la suspensión a través de una gasa estéril y se lavó tres veces por centrifugación a 3500 g por 10 min en PBS. Se adicionaron al sedimento 10 ml de PBS, se autoclavó a 120°C bajo 1,5 atmósferas por 20 min y se centrifugó a 12,000 gravedades (g) por 20 min, a 4°C. El sobrenadante se almacenó en alícuotas de 200 µl a -20°C para ser usado posteriormente.
Protocolo 2 (Daltro de Oliveira et al., 2011): Una parte del extracto de proteínas totales obtenidas en el protocolo anterior se sometió a 3 ciclos de sonicación de 60 s cada uno a 40 Hz (Hertz), en un baño de hielo, con 1 min de intervalo entre los ciclos. Se centrifugó a 12,000 g por 20 min a 4°C y el sobrenadante se almacenó en alícuotas de 200 ul a -20°C para ser usado posteriormente.
Protocolo 3 (Connolly et al., 2006): Las cepas se sembraron en 250 ml de TSC, se incubaron a 37°C en agitación por 24 h y se centrifugaron a 8,000 g por 15 min a 4°C. El sedimento se lavó dos veces con buffer salino fosfato (PBS) y se resuspendió en 100 ml de buffer de lisis 1 (15 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,45 M sucrosa, 8 mM EDTA, y 0,4 mg/ml lisozima). Las muestras se incubaron por 15 min a 4°C, se centrifugaron a 8,000 g por 15 min y se les adicionaron 3 ml de buffer de lisis 2 [50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5 mM MgCl2, y 2 mM de un inhibidor de proteasas].
Las muestras se sonicaron en hielo utilizando un ciclo continuo de siete pulsos de 1 min y se centrifugaron dos veces a 3,000 g por 15 min. El sobrenadante se centrifugó a 43,500 rpm por 90 min, los sedimentos se recolectaron y se resuspendieron en 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) con 2 mM de un inhibidor de proteasas.
Protocolo 4 (Yang et al., 2011): La extracción de proteínas se realizó previamente según lo informado por Henningsen et al. (2002). Brevemente, las bacterias se centrifugaron a 6,000 g durante 10 min a 4°C, se lavaron cuatro veces con PBS frío y se resuspendieron en 50 mM Tris-HCl (pH 7,5). Las células se sometieron a sonicación durante 10 min y se centrifugaron 2,000 g a 4°C durante 10 min. El sobrenadante se mezcló con 10 volúmenes de 0,1 M Na2CO3 (pH 11,0) frío. La mezcla se incubó en un baño de hielo con agitación constante durante 1 h y se centrifugó a 4°C a 46,000 g durante 1 h. Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento con 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) y se centrifugó a 4°C a 46,000 g por 2 h. Se descartó el sobrenadante, el sedimento se lisó en tampón de lisis (5 M de urea, 2 M tiourea, CHAPS 2%, 1% SB 3-10, 1% ASB-14, 1% DTT) a temperatura ambiente durante 1 h y se centrifugó a 46,000 g durante 30 min. El sobrenadante se almacenó a -70°C.
Protocolo 5 (Zhao et al., 2011): Se tomaron 200 ml de cultivo celular en la fase de crecimiento estacionario, se recogieron por centrifugación a 4,000 g durante 15 min a 4°C. Los sedimentos se lavaron dos veces con buffer “low-salt” (3 mmol L-1 KCl, 1,5 mmol L-1 KH2PO4, 68 L-1 mmol de NaCl, 9 mmol L-1 NaH2PO4) y se resuspendieron en tampón de sonicación (urea 8 molar, 1% de ditiotreitol, 4% CHAPS y una tableta completa de cóctel inhibidor de proteasa), posteriormente se sonicó en hielo. La solución se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 h y se centrifugó a 12,000 g durante 1 h. El sobrenadante fue almacenado a -70ºC hasta su uso.
Determinación de la concentración de proteínas: A cada uno de los extractos obtenidos en el paso anterior, se le realizó la cuantificación de proteínas por el método BCA (ácido bicinconínico) con el estuche comercial de Thermo Scientific. Brevemente, a partir de una curva de estándares de concentración conocida de BSA (albumina sérica bovina), se determinó la concentración de proteínas de cada una de las muestras por espectrofotometría utilizando un lector de ELISA. Se corrió también un SDS-PAGE al 12% para evaluar la calidad de los extractos. De acuerdo a la concentración de proteínas y a la calidad del extracto, se escogió un protocolo para realizar los extractos para proceder con el paso de Western Blot.
Obtención de muestras de suero para el Western Blot: Se utilizaron 50 muestras de suero de caninos clasificados en 4 grupos de acuerdo a los resultados en las pruebas 2ME-PARP y hemocultivo, que se encontraban almacenadas en un banco de sueros del grupo Biogénesis-Vericel, producto de investigaciones anteriores realizadas en caninos de criaderos urbanos y rurales; a todas estas muestras se les realizó previamente 2ME-PARP y hemocultivo en otros estudios (Castrillón-Salazar et al., 2013; Sánchez-Jiménez et al., 2014).
Las muestras de suero se clasificaron en los siguientes grupos:
Grupo 1: suero de caninos con 2ME-PARP negativa y hemocultivo negativo.
Estandarización de la prueba de Western Blot: Con las proteínas extraídas por los cinco protocolos, se evaluó cuál era el mejor protocolo de extracción y cuál era el peso molecular aproximado de las proteínas inmunorreactivas.
Se realizó un gel de SDS-poliacrilamida al 12% con un gel concentrador al 5% (MacPhee 2010), se sembraron 150 ug de proteína con buffer de carga y se puso a migrar a 100 voltios por 30 min y posteriormente a 120 voltios por 1 h aproximadamente, se usó como marcador de peso molecular de proteínas Precision Plus Protein™ dual color (Biorad, Hercules, CA, USA).
Posteriormente, se realizó la transferencia de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa utilizando el equipo de transferencia húmedo de Biorad Mini-Protean Tetra Cell y el Módulo Trans-Blot, con un buffer de corrida de Tris-HCL 25 mM, 192 mM glicina y 20% metanol (Towbin et al., 1979) a 100 voltios por 1 h. Después de la transferencia, la membrana fue bloqueada con 100 ml de buffer de bloqueo TBS-T 1x (tris buffer fosfato más tween 20% al 0,5%) con leche descremada al 5%, a 4°C toda la noche. Posteriormente, las membranas se lavaron tres veces por 5 min con TBS-T.
Luego se verificó la presencia de proteínas en la membrana con el colorante Ponceau y fue cortada en tirillas, cada tirilla se puso a reaccionar con un “pool” de sueros de cada uno de los grupos mencionados anteriormente, se incubaron a 37°C durante 1 h con varias diluciones 1:100, 1:200 y 1:500 del “pool” de sueros de cada uno de los grupos, estos fueron los anticuerpos primarios de la reacción. Posteriormente, cada tirilla se lavó de nuevo con TBS-T tres veces por 5 min y se incubó con anticuerpos anti IgG de perro conjugado con peroxidasa de rábano picante, se ensayaron dos diluciones 1:5,000 y 1:10,000 y se incubaron por 1 h a 37°C. Después, las tirillas se lavaron cuatro veces por 5 min con TBS-T y se agregó como sustrato una solución con DAB (1 mg/ml diaminobenzidina y 0,25 ul/ml de H2O2 al 30% en PBS-T), hasta desarrollar color.
Finalmente, el gel que fue transferido se tiñó con azul de Coomassie y se decoloró con solución desteñidora (agua, metanol y ácido acético).
Los ensayos de estandarización se realizaron para cada condición modificada por duplicado.
Se determinó visualmente el peso molecular de las proteínas de interés comparando con el marcador de peso molecular y a partir del análisis de los resultados de cada grupo de sueros. Se estableció si las proteínas identificadas correspondían al mismo peso molecular o si eran diferentes para cada grupo.
Determinación de la sensibilidad y especificidad de la prueba de Western Blot: Luego de tener estandarizada la prueba, en un análisis ciego se evaluó su sensibilidad y especificidad frente a la prueba 2ME-PARP y el hemocultivo, realizando el Western Blot a 10 sueros de cada grupo (en total 50 pruebas).
Análisis estadístico: A partir de tablas de 2x2 comparando los resultados de la prueba de Western Blot frente al 2ME-PARP o hemocultivo y utilizando el software SPSS versión 22, se determinaron los valores de Sensibilidad (S), Especificidad (E), Valor Predictivo Positivo (VPP) y Valor Predictivo Negativo (VPN). Se establecieron también los intervalos para cada uno de estos valores con un nivel de confianza del 95% y la concordancia de las pruebas mediante la determinación del Índice Kappa.
Aval del comité de ética: Este trabajo fue autorizado para su realización por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Antioquia, acta No. 77 del 12 de junio de 2012.
Resultados y Discusión
Extracción y cuantificación de proteínas: De los cinco métodos utilizados y posterior a la cuantificación de la concentración de proteínas, se estableció que el mejor protocolo fue el propuesto por Zhao et al. (2011).
Prueba de Western Blot: Se utilizó para la realización de las pruebas de Western Blot, el extracto proteico de la cepa B. canis str. Oliveri, pues esta cepa se aisló de un canino de Medellín. Con el extracto proteico escogido, se estandarizaron las condiciones para la realización de la prueba de Western Blot; el suero de los caninos se estandarizó a una dilución de 1:500 y una dilución del anticuerpo secundario anti IgG canino de 1:6,000.
Se probaron 50 sueros divididos en los 4 grupos previamente mencionados. Los resultados de 2ME-PARP, Hemocultivo y Western Blot se pueden ver en la Tabla 1.
Determinación de la sensibilidad, especificidad de la prueba de Western Blot: A partir de los resultados presentados en la Tabla 1, se encontró que ciertas bandas fueron específicas para cierto grupo de muestra. Por lo anterior, se dividió el resultado del Western Blot como muestras positivas a bandas de bajo peso molecular (12, 18 y 20 kDa), muestras positivas a las bandas 48 y 70 kDa y muestras positivas a las bandas de 40 y 55 kDa.
Todas las muestras fueron positivas a la banda de 65 kDa, por lo cual esta se consideró una banda inespecífica. En la Figura 1 se observa el gel y el Western Blot para sueros del grupo 2. (Figura 1)
En la Tabla 2 se pueden observar los resultados de S, E, VPP, VPN e Índice Kappa para cada grupo de bandas evaluadas por Western Blot. Tabla 2
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Cuando se compararon bandas de bajo peso molecular frente a los resultados de hemocultivo, 29 (58%) de las muestras tuvieron resultados concordantes.
Cuando se compararon las bandas de 48 y 70 kDa frente al hemocultivo, 41 (82%) de las muestras tuvieron resultados concordantes.
Cuando se compararon las bandas de 40 y 55 kDa frente al 2ME-PARP, 29 (58%) de las muestras tuvieron resultados concordantes.
En la actualidad existen varias pruebas de diagnóstico disponibles para la detección de la infección causada por Brucella canis tanto en perros como en humanos, sin embargo estas pruebas no son lo suficiente sensibles y específicas (Erdenliğ et al., 2011). En este trabajo se encontró que dependiendo del estadio de la infección del canino, el cual se estableció analizando los resultados de las pruebas 2ME-PARP y hemocultivos, hay un grupo específico de bandas inmunorreactivas. En el caso de presentar inmunorreactividad con las bandas de 12, 18 y 20 kDa se podría afirmar que el canino presenta una infección aguda, pero si en el Western Blot se observan bandas inmunorreactivas de alto peso molecular como las de 40, 48 y 55 kDa se podría decir que el canino está en una etapa crónica de la infección.
El perfil del grupo dos, positivo para ambas pruebas, reveló que las bandas específicas para este grupo son las bandas 48 kDa y 70 kDa (Figura 2); algunas de las bandas reportadas inmunorreactivas en este estudio habían sido identificadas previamente por Daltro de Oliveira et al. en el 2011, quienes reportan seropositividad para B. canis con las bandas de 18 kDa, 39 kDa, 62 kDa y 78 kDa, pesos muy similares a los encontrados en este trabajo.
En los estudios realizados por Serikawa et al. en 1989 y Barrouin-Melo et al. en 2007 describen una banda de proteína 65 KDa, relacionada con la seropositividad de los caninos; a diferencia de ellos, en este trabajo se encontró esta banda en cada uno de los grupos estudiados, por lo cual esta banda puede ser una proteína inmunorreactiva del hospedero. Sin embargo, la diferencia de estos hallazgos se puede deber a la diferencia de la cepa bacteriana utilizada para realizar los dos trabajos, pues los otros autores emplearon la cepa M- y en el presente trabajo se utilizó una cepa silvestre aislada de un canino de criadero de la ciudad de Medellín (Castrillón-Salazar et al., 2013).
Delpino et al. (2004) reportaron bandas inmunorreactivas de 6, 22, 30, 42 y 60 kDa, de estas bandas en el presente trabajo se encontró similitud con las bandas de 18, 45 y 65 kDa, aunque ellos no especifican la relación con pacientes sanos o infectados.
También Barka et al. en 2011 reportaron bandas inmunorreactivas en un rango entre 18 y 80 kDa (18, 28, 45, 68, 70 y 80 kDa), y otras bandas inmuno-dominantes de 12, 28, 39 y 45 kDa, estas bandas tienen similitud con las bandas encontradas en el presente estudio.
Finalmente, se concluye que esta prueba podría complementar el diagnóstico de la infección por Brucella canis en caninos, en casos en los cuales el hemocultivo no esté disponible pero sí el 2ME-PARP, pues el Western Blot tiene muy buena sensibilidad y podría detectar anticuerpos en bajos concentraciones, lo cual con aglutinación podría ser difícil en algunos casos. Comparando con el hemocultivo, la utilidad del Western Blot sería aún mayor, pues en casos en los cuales por la intermitencia de la bacteremia la bacteria no pueda ser detectada por hemocultivo, el Western Blot sí podría detectar anticuerpos circulantes y así se podría diagnosticar la infección. Además, el Western Blot sería de mucha utilidad en el seguimiento de caninos con fuerte sospecha de infección por contacto con caninos infectados pero con serología negativa, puesto que el Western Blot sería positivo más rápido que la aglutinación por lo ya mencionado anteriormente, la capacidad de detectar títulos de anticuerpos circulantes más bajos que la prueba 2ME-PARP.
Conclusiones
Este trabajo permitió identificar la inmunorreactividad de sueros de caninos infectados frente a bandas de 48 y 70 kDa, las cuales al compararse con los resultados de 2ME-PARP y el hemocultivo presentaron una concordancia moderada y buena, respectivamente.
Agradecimientos
A la Dra. Zulma Tatiana Ruiz directora del grupo Biogénesis por los recursos asignados a este proyecto dentro de la estrategia de sostenibilidad 2013-2014 del grupo Biogénesis, y a COLCIENCIAS por la financiación de una joven investigadora.
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Indicadores conductuales y signos de sensibilidad usados para evaluar el bienestar animal durante el sacrificio de bovinos
ARTÍCULO DE
(Recibido: octubre 14, 2013 Aprobado: noviembre 29, 2013 Actualizado: diciembre 20, 2013)
RESUMEN: Los indicadores conductuales y de manejo consisten en criterios cuantitativos no invasivos para los bovinos, que permitan hacer un seguimiento durante las actividades de inspección, vigilancia y control por parte de las autoridades sanitarias en las plantas de sacrificio. A su vez, pueden hacer parte de los programas de aseguramiento de la calidad de la industria durante su implementación, mejoramiento y auditoría, con el fin de evitar pérdidas económicas, facilitar el manejo del ganado, garantizar la inocuidad de la carne y evitar riesgos ocupacionales. Las variables evaluadas son: 1) Porcentaje de animales efectivamente insensibilizados en el primer intento, 2) Porcentaje que permanecen insensibles, 3) Porcentaje que vocaliza durante la conducción, 4) Porcentaje que cae durante el manejo, y 5) Porcentaje que es movilizado con tábano eléctrico. El sistema de puntuación consiste en una medida estandarizada, que puede ser fácilmente implementada tanto en grandes como en pequeñas plantas de sacrificio de bovinos. El objetivo de esta revisión es presentar y proponer indicadores de comportamiento en el cajón de insensibilización y de sensibilidad para evaluar el bienestar animal durante el sacrificio de bovinos en plantas comerciales.
Palabras clave: comportamiento, insensibilización, manejo
Behavior indicators and stunning signs used to assess animal welfare during cattle slaughter
ABSTRACT: The behavior and management indicators consist in non-invasive quantitative criteria for cattle, which allow tracking during the inspection, surveillance and control activitiesbythe sanitary authorities inslaughter plants. In turn, they may be part of the programs of quality assurance in the industry during its implementation, improvement and audit, in order to avoid economiclosses, facilitate the management of livestock, ensure the meat safety and prevent occupational hazards. Thevariables measuredare: 1) Percentage of animals effectively stunned in the first attempt; 2) percentage of animals that remain stunned; 3) percentage that vocalizes during conduction; 4) percentage that fall during handling; and 5) percentage moved with an electric goad. The scoring system is a standardized measurement that can be easily implemented in both large and small bovinesslaughter plants. The aim of this review was to present and propose behavior indicators in the stunning box and sensitivity to assess animal welfare during the cattle slaughter in commercial plants.
Key words: behavior, stunning, handling
Introducción
El bienestar animal (BA) ha sido considerado como un componente importante para asegurar la calidad e inocuidad de los alimentos (Fike & Spire, 2006). Esta tendencia ha consolidado la inclusión de estándares de BA en la legislación de los países exportadores de carne (Argentina, Brasil, Canadá, Estados Unidos y Uruguay) y en los emergentes (Chile, México y Colombia), de acuerdo con las recomendaciones de la Organización de la Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) (Schnettler et al., 2000; Rojas et al., 2005). Colombia actualizó su legislación sanitaria con un enfoque “desde la granja hasta la mesa”, integrando los lineamientos de BA en la producción primaria de bovinos y bufalinos y el faenado (ICA, 2007; Romero & Sánchez, 2011).
El sacrificio (insensibilización y sangría) de los bovinos, es considerado una etapa crítica, que afecta el BA, la calidad e inocuidad de la carne (Velarde et al., 2003). Desde el punto de vista del BA, el sacrificio tiene como finalidad evitar el sufrimiento y estrés a los animales al momento de provocarles la muerte (OIE, 2012), mediante el uso de sistemas de insensibilización que garanticen la pérdida de consciencia instantáneamente, y se mantenga este estado hasta la muerte (MPS, 2007, 2013). A pesar de que la legislación colombiana ha definido requerimientos de BA para las plantas de sacrificio, es frecuente el uso de términos ambiguos que no facilitan una evaluación objetiva de su cumplimiento, así como, la obtención de indicadores cuantitativos no invasivos que permitan hacer un seguimiento durante su implementación, mejoramiento y auditoría por parte de la industria y durante los procesos de inspección, vigilancia y control de las autoridades sanitarias. El objetivo de esta revisión es proponer y describir indicadores de comportamiento y de sensibilidad, que son utilizados para evaluar el BA durante el sacrificio de bovinos, excluyendo los rituales religiosos.
El concepto del bienestar animal
El BA es una ciencia que tiene implicaciones éticas y productivas. De acuerdo con la OIE, el BA designa el modo en que un animal afronta las condiciones de su entorno, por lo tanto, un animal en buenas condiciones de bienestar está sano, cómodo, bien alimentado, en seguridad, puede expresar formas innatas de comportamiento, sin padecer sensaciones desagradables de dolor, miedo o desasosiego (OIE, 2012). Se han descrito como condiciones básicas que aseguran el bienestar de los animales cinco componentes que se han denominado “las cinco libertades”: 1) Libre de hambre, sed o un nivel de nutrición insuficiente; 2) No presentar dolor, heridas o enfermedad; 3) Libre de temor o angustia; 4) No presentar incomodidad y 5) Libre de manifestar un comportamiento natural, las cuales deben regir el BA (Broom & Molento, 2004). El concepto de BA adoptado por la OIE se basa en la definición propuesta por el profesor Donald Broom (1986), “el bienestar es un estado del organismo durante sus tentativas de ajustarse con su ambiente”, por lo tanto, hace referencia a una característica del individuo en un momento dado, siendo necesario tener en cuenta las siguientes implicaciones: a) El BA es una característica de un animal, no es algo que pueda ser proveído a él; las acciones humanas pueden mejorar el BA, mas no se refiere como BA proporcionar un recurso o una acción; b) Tiene una escala de valoración, pudiendo variar entre deficiente o muy bueno; c) Puede ser medido y su interpretación debe ser objetiva. La falta de bienestar no es necesariamente sinónimo de sufrimiento (Broom & Molento, 2004).
Indicadores de bienestar animal
Existe una variedad de parámetros de comportamiento, fisiológicos, inmunológicos, físicos y patológicos que han sido propuestos para evaluar el BA y las características de manejo del ganado en las plantas de sacrificio (Figura 1).
Los indicadores fisiológicos están relacionados con el nivel de estrés sufrido por los animales en diferentes etapas del proceso (Miranda-de la Lama et al., 2012). Tienen como ventajas que pueden ayudar a entender el costo biológico de la adaptación de los animales a los procesos del manejo previo en la finca, durante el transporte, permanencia en la planta de beneficio y durante el sacrificio (insensibilización y sangría) (Gallo & Tadich, 2008; Gregory, 2008; Miranda-de la Lama et al., 2010). Sin embargo, tienen como desventajas que son invasivos, algunas mediciones requieren de técnicas especializadas, las muestras se procesan en el laboratorio, los resultados no se obtienen inmediatamente durante un proceso de auditoría y no discriminan los factores que los desencadenaron, con la finalidad de implementar correctivos en las plantas. Es necesario además, interpretar con precaución los resultados de las mediciones fisiológicas, porque pueden indicar estados prepatológicos de los bovinos (Broom & Molento, 2004). Dentro de los biomarcadores descritos sobresalen la medición de cortisol y progesterona, las concentraciones de albúmina plasmática, urea, globulina, proteínas totales, la actividad de la enzima creatinfosfoquinasa (CK), ß-hidroxibutirato (ß-OHB), haptoglobina, fibrinógeno, el volumen celular acumulado (VCP) y el conteo de leucocitos, entre otros (Gallo et al., 2003a; Amtmann et al., 2006; Knowles & Warriss, 2006).
Los indicadores patológicos son muy importantes porque el bienestar de los animales enfermos casi siempre es más pobre que el de los animales sanos (Figura 1). Se han utilizado como indicadores patológicos la presencia de bovinos de descarte con mastitis y cojeras, animales jóvenes con diarrea, las alteraciones del tegumento (pelo, piel, pezuñas y cuernos) e índice de condición corporal, entre otros (Paranhos da Costa & Tarazona, 2011). De acuerdo con la legislación sanitaria, todos los bovinos que ingresan a las plantas de beneficio deben ser sometidos a un proceso de inspección ante-mortem (MPS, 2007, 2013). Durante la inspección, se pueden observar algunas condiciones de los bovinos que son indicadores de problemas de BA en las fincas, durante el transporte o el manejo, las cuales pueden ser medidas fácilmente en las plantas de sacrificio. La condición corporal permite identificar la proporción de animales emaciados o muy delgados, asimismo, el porcentaje de animales con cojeras, considerados como indicadores de pobre BA especialmente en pollos de engorde y bovinos de leche (Whay et al., 2003; Espejo et al., 2006). La presencia de animales muertos puede estar relacionada con el manejo rudo, problemas genéticos, metabólicos o sanitarios de los animales y con altas densidades de carga de los camiones (Fitzgerald et al., 2009). De igual forma, los indicadores inmunológicos se pueden ver afectados en animales con problemas de manejo y alojamiento. Un ejemplo de los indicadores inmunológicos usados para evaluar el bienestar son la relación neutrófilos/linfocitos y el funcionamiento de las citoquinas, fibroblastos y los linfocitos T (Broom, 2006). Estos indicadores tienen mayor uso para evaluar los sistemas productivos y durante el transporte (Broom, 2006).
Los indicadores físicos se pueden evaluar durante la inspección ante-mortem cuando se evidencian principalmente animales fracturados o con lesiones como traumatismos severos y hernias. En el caso de animales fracturados, la planta debe contar con las instalaciones y los manuales de procedimientos que permitan realizar el beneficio de emergencia bajo condiciones humanitarias (MPS, 2013). A diferencia, las contusiones a pesar de que son infringidas en el ganado vivo, estas solo son visibles durante la inspección post-mortem, en forma de contusiones de distinta forma, profundidad y extensión; debido al grosor de la piel de los bovinos, que hace imposible su observación durante la inspección ante-mortem (Gallo, 2008; Strappini et al., 2009). Su evaluación se convierte en una importante fuente de información para establecer los factores de riesgo relacionados con su aparición y sus probables causas (Nanni Costa et al., 2006; Strappini et al., 2010). Un ejemplo de los indicadores físicos se observa en la Figura 2, en donde se presentan contusiones localizadas en la tuberosidad coxal, que sugieren que el bovino se golpeó contra la carrocería del camión o en las instalaciones (Figura 2a). En la Figura 2b, se observa una canal con lesiones múltiples, característica de los bovinos que se han caído durante el transporte y han sido pisoteados por otros animales (Romero et al., 2012a; Romero et al., 2013; Strappini et al., 2013).
Los indicadores de comportamiento evalúan condiciones que están relacionadas con malas prácticas de manejo, negligencia, abuso de los animales o equipos mal diseñados (Sejian et al., 2011). Estos indicadores han sido ampliamente recomendados por investigadores. Asimismo, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) los ha implementado durante las actividades de inspección, vigilancia y control en los frigoríficos de este país. De igual forma, multinacionales productoras de alimentos seleccionan sus proveedores de carne de acuerdo con los resultados obtenidos mediante auditorías de indicadores basados en el animal (Grandin, 2010a). Estos indicadores se presentarán en detalle a continuación, cuando son usados especialmente en el cajón de insensibilización.
Indicadores para implementar en las plantas de beneficio
Los indicadores utilizados para evaluar el BA deben tener las siguientes características: a) basarse en el conocimiento científico; b) permitir conocer la tendencia de la medición en el tiempo; c) ser medibles cuantitativamente bajo condiciones comerciales; d) relevantes como soporte para la toma de decisiones de las plantas de beneficio y e) suministrar información sobre posibles problemas de BA y sus causas (Sejian et al., 2011). Los indicadores basados en el animal para evaluar el bienestar animal durante el sacrificio, tal como lo propone Grandin (2010c) se basan en la evaluación de cinco criterios: a) Porcentaje de ganado insensibilizado efectivamente; b) Porcentaje de ganado que permanece insensible después del izado; c) Porcentaje de bovinos que resbalan o caen durante el manejo; d) Porcentaje de ganado que vocaliza durante el manejo y el sacrificio, y e) Porcentaje de bovinos conducidos con tábano eléctrico. La Tabla 1 presenta un esquema de estos indicadores, los criterios de evaluación y los niveles de puntuación empleados. El tamaño de muestra sugerido para la evaluación es de mínimo 100 bovinos, los cuales se deben seleccionar aleatoriamente preferiblemente en diferentes días y turnos del proceso en las plantas de sacrificio (Grandin, 2006b; Grandin, 2010b; Grandin, 2010c). Sin embargo, la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) propuso un modelo matemático para calcular el tamaño de muestra requerido para monitorear el aturdimiento en plantas comerciales, de acuerdo con los siguientes criterios: población total sacrificada, la sensibilidad de los indicadores usados para determinar la recuperación de la consciencia de los animales, la fracción de muestreo (proporción de la muestra que se evaluará con el protocolo seleccionado), la exactitud del protocolo del muestreo (% de situaciones en que se aplicó el protocolo e identificó correctamente la presencia de consciencia en los animales evaluados), tasa de fracaso del protocolo (proporción mínima de animales ineficazmente insensibilizados que son detectados por este) (EFSA, 2013a). La implementación de este sistema de muestreo de forma rutinaria presenta limitaciones, porque requiere de un programa estadístico para el cálculo del tamaño de muestra, por tanto se recomienda el uso del criterio sugerido por Grandin (2010b), el cual ya fue descrito. A continuación se realizará una descripción de cada uno de los indicadores propuestos por Grandin (2010c) para facilitar su implementación (Tabla 1).
Efectividad de la insensibilización y animales que permanecen insensibles durante la sangría
La efectividad de la insensibilización se logra cuando el impacto con las pistolas con o sin perno cautivo se realiza en la mitad del hueso frontal, en el punto de encuentro entre dos líneas imaginarias que parten de cada ojo en diagonal hacia la base de los cuernos opuestos, en una posición no superior a los 2 cm de este punto (Figuras 3a y 3b), porque es el sitio en donde el cerebro se encuentra más cerca de la superficie del cráneo (Sejian et al., 2011). Este criterio se evalúa mediante la valoración del número de impactos requeridos para inducir la insensibilidad y su ubicación. Para ello se utiliza una plantilla que se localiza sobre la frente del animal, para identificar el área donde se produjo el impacto, midiendo la distancia (cm) existente entre el orificio dejado por el(los) impacto(s) del proyectil y el blanco ideal (Figura 3).
Para considerarse como efectiva la insensibilización, es necesario además que estén ausentes la respiración rítmica regular, el reflejo corneal o movimiento ocular negativo, la presencia de globo ocular fijo (no girado), la ausencia de vocalizaciones, el intento del animal de incorporarse y la presencia de la lengua flácida cuando el animal está izado (Gregory et al., 2007; Gregory et al., 2009). La evaluación de la efectividad de la insensibilización se realiza inmediatamente después de que los bovinos son expulsados del cajón de insensibilización y durante el izado, registrando la presencia/ausencia de los signos indicadores de sensibilidad:
- Reflejo corneal o movimiento ocular. Se registra el parpadeo o el movimiento ocular, cuando el evaluador coloca los dedos sobre la córnea del bovino (Figura 4a) (Gregory et al., 2007).
- Respiración rítmica regular. La presencia de movimientos rítmicos en el flanco de los animales se considera como indicador de consciencia y por tanto de sensibilidad (Figura 4b), o al poner la mano en las fosas nasales y percibir la fuerza del aire expirado en forma rítmica (Figura 4c) (Gallo et al., 2003b).
- Elevación de cabeza y cuello, o cualquier intento de incorporarse. Se evalúa en el cajón de aturdimiento y hasta la sangría, registrando aquellos casos en que el animal intente levantar la cabeza o cualquier otro movimiento que indique un intento de incorporación (Grandin, 2010c).
- Lengua flácida y extendida. Se analiza la posición de la lengua del bovino izado, la cual debe estar por fuera de la boca, con los músculos relajados y observarse derecha, sin movimientos de “enroscamiento” (Gregory et al., 2007) (Tabla 1).
Por ningún motivo se debe apreciar alguno de estos signos durante la sangría y al inicio de las actividades posteriores (corte de cabeza, extremidades, entre otros); por lo tanto, tiene un límite de tolerancia cero (Tabla 1) (Grandin, 2010b).
Los movimientos laterales del cuello con la relajación en pocos segundos, no son considerados como retorno a la sensibilidad. De igual forma, los movimientos incoordinados de las extremidades se deben ignorar porque se deben a reflejos espinales (Grandin, 2010b). En trabajos realizados en plantas colombianas, los signos de retorno a la inconsciencia más frecuentes fueron la respiración rítmica, el reflejo palpebral e intentos de incorporarse (Romero et al., 2012b; Romero et al., 2012c). El primero denota que la función medular fue parcialmente afectada, reduciendo las probabilidades de que ocurra falla cardiopulmonar y generando un mayor riesgo para que los bovinos recuperen la consciencia (Figura 4b) (Gregory et al., 2007; Bourguet et al., 2011). El reflejo palpebral es considerado un importante indicador de inconsciencia (Figura 4a) (Grandin, 2010b), cuyos reflejos involucran los nervios craneales y circuitos que viajan a través de la protuberancia y el bulbo raquídeo, hasta el núcleo espinal del trigémino (Bourguet et al., 2011; EFSA, 2013b). El intento de incorporase es catalogado como uno de los indicadores más fiables de retorno a la sensibilidad (Grandin, 2010c).
Impacto efectivo
Los autores han encontrado que es frecuente apreciar la falla en los aciertos con la pistola de insensibilización y la localización de los impactos en la articulación atlanto-occipital, por problemas de diseño del cajón de insensibilización, ausencia o ineficiente sistema de sujeción de la cabeza (Figura 5a) y escasa capacitación de los operarios (Romero et al., 2012b; Romero et al., 2012c). La localización del impacto de la pistola en la articulación atlanto-occipital no garantiza la insensibilización efectiva, porque produce parálisis del animal, sin la pérdida de la consciencia (Gregory, 2008). Una insensibilización efectiva depende de la fuerza del proyectil, el ángulo de la pistola y la localización correcta del impacto (Gallo et al., 2003b; Cáraves & Gallo, 2007). Es prioritario calibrar el equipo de acuerdo con el tipo de ganado a sacrificar, teniendo en cuenta que la densidad ósea del hueso frontal en la hembras es más baja que la de los machos, y en el caso de los búfalos se requerirá mayor presión porque los huesos son más densos, de esta forma se previene la presencia de animales mal insensibilizados, siendo necesario aplicar un segundo impacto (Gallo et al., 2003b). Cuando la presión es excesiva, ocasiona fracturas del hueso frontal, como se observa en la Figura 5a. Se considera que una planta de sacrificio tiene una puntuación excelente en este parámetro, cuando el 99% o 100% de los bovinos evaluados quedan insensibilizados en el primer intento, y como aceptable cuando este criterio se encuentra entre el 95 y 98% (Tabla 1). Si este parámetro se encuentra por debajo del 95%, indica la presencia de un problema serio de BA y la gerencia de la planta debe tomar acciones correctivas inmediatas (Grandin, 2010a).
Intervalo entre el impacto efectivo y la sangría
Otro criterio relevante para monitorear es el intervalo entre el primer impacto de la pistola usada para la insensibilización y el inicio de la sangría, que se mide usando un cronómetro (EFSA, 2013b). Cuando se utiliza pistola de perno retenido con penetración debe ser de un minuto máximo; a diferencia, cuando es con pistola de perno retenido sin penetración, será 30 seg (Gregory, 2008; Grandin, 2010b). Un intervalo de mayor duración (>1 min), favorece la recuperación de la consciencia de los animales y el sufrimiento durante la sangría (EFSA, 2013b). Los factores que pueden contribuir a retrasar el inicio de la sangría en las plantas colombianas son: falta de coordinación entre los operarios responsables de la insensibilización y la sangría, dificultad de expulsar los animales del cajón de insensibilización por fallas de diseño, pobre entrenamiento y capacitación del personal, falta de calibración y mantenimiento del equipo, uso de cartuchos húmedos y cansancio del personal por sobrecarga de funciones (Romero et al., 2012b; Romero et al., 2012c). Estos problemas han sido identificados también por otros investigadores (Gallo et al., 2003b; Bourguet et al., 2011; Miranda-de la Lama et al., 2012).
Indicadores durante el manejo y en el cajón de insensibilización
El comportamiento de los bovinos refleja una mezcla de diferentes emociones, siendo el miedo el sentimiento de mayor interés para evaluar la interacción con el hombre durante el manejo, porque refleja el acoplamiento del hombre en su estructura social, las experiencias pasadas con sus manejadores y el tipo de manejo recibido en las granjas (Breuer et al., 2003). Durante la conducción hacia el área de aturdido y dentro del cajón de insensibilización, se registra la presencia de las resbaladas o caídas, el uso de tábano eléctrico y las vocalizaciones de los bovinos, siendo por tanto necesario realizar esta actividad por lotes, registrando el total de estos eventos para establecer posteriormente la frecuencia relativa (%), que resulta al dividir el número de eventos, por el total de animales evaluados y se multiplica por 100. Este criterio permite definir si se encuentran en los valores considerados como aceptables (Tabla 1). Para que la medición sea objetiva, el evaluador se debe localizar en un lugar donde no interfiera con el comportamiento natural de los bovinos y con las labores normales de manejo.
Proporción de animales que caen o resbalan
El manejo tranquilo de los animales en el cajón de insensibilización no es posible si se presentan caídas o resbaladas, por lo tanto los pisos de esta área deben ser antideslizantes (Gallo et al., 2003b). Se considera como caída la pérdida repentina de la posición vertical del animal, cuando alguna parte del cuerpo distinta a las extremidades toca el suelo (Grandin, 2010a). Cuando se presenta durante la evaluación una proporción mayor del 1% de caídas, se recomienda revisar las prácticas de manejo y las características de las instalaciones, principalmente los pisos (Muñoz et al., 2012).
Uso de tábano o picana eléctrica
El uso de elementos eléctricos para la movilización de los animales es un factor de estrés para el ganado y los cerdos. Esta práctica es prohibida por la OIE para ser usada en caballos, ovejas y cerdos pequeños (OIE, 2012). Se ha descrito que solo puede aplicarse en los casos en que los animales rehúsen a moverse y cuando el ganado disponga de espacio suficiente para incorporarse, así como, cuando se encuentren acostados y no tengan afecciones que interfieran con la movilización (Manteuffel et al., 2004). La OIE solo autoriza el uso de estos elementos cuando son accionados por batería y con voltaje no superior a los 30 V (Grandin, 2001). Cuando el uso del tábano eléctrico es <5% se considera el criterio como excelente (Tabla 1). En las plantas colombianas se abusa del tábano eléctrico durante la conducción de los bovinos principalmente, porque el personal desconoce criterios del comportamiento del ganado y el diseño de las mangas de conducción es inapropiado (Romero & Sánchez, 2011). Se ha detectado, además, que es frecuente la colocación de este elemento en las partes sensibles del animal como cara y genitales, lo cual en las plantas de Estados Unidos es causa de pérdida de las auditorías de bienestar animal (Grandin, 2010c). Asimismo, se evidenció su utilización en dos plantas colombianas para inmovilizar los bovinos en los cajones de insensibilización (Romero et al., 2012b). Estudios recientes realizados en Chile y Francia, han descrito la utilización excesiva del tábano eléctrico, los golpes con la puerta de guillotina para acelerar la entrada de los bovinos al cajón de insensibilización y la utilización del tábano eléctrico como sistema de sujeción del animal, para facilitar la colocación de la pistola, lo cual refleja que son problemas generalizados y no solo de las plantas colombianas (Bourguet et al., 2011; Muñoz et al., 2012), haciendo evidente que la insensibilización es una etapa que requiere de mayor investigación.
Las vocalizaciones
Las expresiones acústicas juegan un papel importante en la comunicación de muchas especies animales, porque sirven para alertar a la manada y son un indicador del estatus de BA fácil de medir (Manteuffel et al., 2004). Se ha encontrado que este indicador es muy eficiente para identificar problemas de los equipos o de manejo inapropiado (Grandin, 2010c). Las vocalizaciones se contabilizan individualmente cuando el ganado interactúa con los manejadores en el cajón de aturdimiento (Grandin, 2010b). El incremento de vocalizaciones ha sido relacionado con el uso excesivo de tábano eléctrico, los resbalones y las caídas (Grandin, 2010a) y durante la insensibilización con problemas del equipo, calibración, mantenimiento, capacitación del personal, animales muy nerviosos, cartuchos húmedos, recuperación de la sensibilidad y la presión excesiva del sujetador de cabezas (Grandin, 2001; Grandin, 2006a). Las vocalizaciones deben estar ausentes en el riel de sangría y deben ser menores del 5% en el cajón de insensibilización, cuando la planta cuenta con un sistema de sujeción de cabeza (Tabla 1). Tal vez, una de las fallas más grandes observadas durante la insensibilización, es la correcta sujeción de la cabeza de los bovinos, porque las plantas tradicionales carecen de un sistema de sujeción, y en las plantas nuevas el diseño y el manejo son generalmente deficientes. En la Figura 5b, se ilustra una aplicación incorrecta, que es frecuente cuando la planta carece de un sistema de sujeción de cuerpo o cuando los cajones tienen dimensiones mayores, no acordes con el peso y el tamaño del ganado colombiano (Romero et al., 2012b; Romero et al., 2012c). Asimismo, se recomienda que la presión no sea excesiva, porque causa dolor y estrés a los bovinos, aspecto que dificulta el manejo. En la Figura 5c, se observa la colocación correcta del sujetador, que debe realizarse en el cuello del bovino, por un tiempo no mayor de 5 seg, por tanto la aplicación del impacto en el cráneo del animal debe ser inmediato (Romero et al., 2012b; Romero et al., 2012c).
Factores que afectan la auditoría de los indicadores
De acuerdo con el manual de auditoría del Instituto Americano de la Carne de los Estados Unidos, existen condiciones denominadas actos voluntarios de abuso animal, que son motivo de pérdida inmediata de una evaluación de BA, entre los cuales se encuentran: a) arrastrar conscientemente a un animal imposibilitado de moverse; b) aplicación intencional de picanas o tábanos eléctricos en áreas sensibles de los bovinos como ojos, orejas, nariz, ano o testículos; c) dar portazos al ganado; d) dar golpes o palizas al ganado; e) presencia de animales hipotérmicos sobre el piso o a los lados del camión, y f) colocar y trasladar intencionalmente otros animales sobre bovinos fracturados o imposibilitados de movilizarse (Weeks et al., 2002; Grandin, 2010c). Sin embargo, es necesario tener en cuenta que el proceso de auditoría solo permite tener una visión instantánea o puntual de la planta, y que existen muchas variables que pueden afectar la auditoría. Estas pueden incluir: a) Cambios de personal; puede tomar tiempo a un empleado nuevo manejar hábilmente el ganado, comparado con un empleado con experiencia; sin embargo, no se puede admitir ningún acto de maltrato animal. b) Raza, edad y sexo de los animales, son factores que pueden afectar el temperamento bovino. c) Manejos previos o falta de contacto humano en la finca; los animales con mayor contacto humano están más tranquilos durante el manejo. d) Clima; los animales pueden reaccionar ante cambios climáticos abruptos, como las tormentas. e) Influencia del auditor; las personas juegan un papel crítico durante la evaluación del manejo animal, por tanto deben tener experiencia y habilidad para interactuar con el personal de la planta durante la auditoría (Grandin, 2010c). Para hacer una evaluación más imparcial de los indicadores, es posible revisar los informes de auditorías anteriores, en especial para verificar el cumplimiento de las medidas correctivas y preventivas, así como, los resultados de seguimiento (Weeks et al., 2002; Warner et al., 2007). Las principales causas de la pérdida de las auditorías de las plantas son: personal sin entrenamiento y poco especializado, distracciones físicas que hacen que los animales no se desplacen eficientemente, problemas de diseño de las instalaciones y equipos (Grandin, 2006b).
Necesidades de implementación
La implementación de estándares de BA durante el beneficio de animales tiene implicaciones éticas, legislativas, sanitarias y productivas, toda vez que su ausencia afecta la calidad, inocuidad e incrementa las pérdidas económicas por la presencia de carne contusa y de menor valor comercial. Los autores han observado que el personal encargado del manejo de los bovinos en las plantas de beneficio se va habituando con el sufrimiento del ganado, lo cual se refuerza con la creencia de que los animales son seres que no sienten y por el poco conocimiento sobre sus demostraciones de miedo y dolor (Romero et al., 2012b; Romero et al., 2012c). Uno de los principales objetivos de la gestión de cualquier planta de beneficio debe ser evitar que las malas prácticas sanitarias y de BA se conviertan en costumbre. En el caso de las prácticas de BA, es fundamental el entrenamiento del personal en prácticas de manejo y comportamiento bovino.
Investigaciones realizadas durante más de 30 años por la profesora Temple Grandin de la Universidad de Colorado de los Estados Unidos, permitieron el desarrollo y la adopción de equipos, diseño de instalaciones y prácticas de manejo de los bovinos por parte de la industria frigorífica de Estados Unidos, Canadá, Australia, Europa y Suramérica. Entre los aspectos considerados por la investigadora como relevantes para lograr la implementación y la mejora de los estándares de BA en las plantas de beneficio, está el compromiso gerencial, el entrenamiento del personal y la auditoría de las prácticas de manejo (Grandin, 2006a; Grandin, 2006b).
La implementación de incentivos económicos para las plantas de beneficio que apliquen prácticas de BA durante el manejo y el sacrificio (insensibilización y sangría) de bovinos, porcinos y aves ha sido efectiva en Estados Unidos, como es el caso de las empresas de alimentos privadas, las cuales realizan auditorías a sus proveedores de carne, llegando a suspender o retirar de sus listas de proveedores a las empresas que incumplían con los parámetros establecidos. Este proceso permitió que más de 50 plantas de beneficio incluyeran dentro de sus departamentos de Aseguramiento de la inocuidad, auditores de BA, así como el entrenamiento y la capacitación de los manejadores de ganado, la disminución del uso de tábanos eléctricos, mejoras en el diseño de las plantas de acuerdo con lineamientos de comportamiento animal y la eficiencia de la insensibilización, entre otros aspectos (Grandin, 2001; Grandin, 2003). Observaciones realizadas por los autores de este artículo en Chile, Brasil, Argentina y Uruguay han permitido verificar que la industria cárnica bovina de estos países ha implementado lineamientos de BA durante el beneficio, con lo cual han logrado un posicionamiento en el mercado interno y en el comercio internacional, incluyendo el BA como un valor agregado de sus productos.
En Colombia, las prácticas de BA animal se encuentran en un nivel incipiente de conocimiento e implementación, siendo necesario por tanto que los currículos de las carreras como Medicina Veterinaria y/o Zootecnia, incluyan en sus programas esta ciencia para preparar a los futuros profesionales que serán responsables de su implementación en la cadena cárnica bovina, se fortalezca la investigación en esta área del conocimiento y se lideren procesos de entrenamiento y capacitación a los involucrados en el manejo animal. De otra parte, es fundamental que las autoridades sanitarias exijan los lineamientos de BA incluidos en la legislación sanitaria e implementen indicadores de BA cuantitativos que permitan el seguimiento de la implementación en la industria, y orienten los procesos de inspección, vigilancia y control. Las auditorías deben ser sistemáticas y periódicas para evaluar las tendencias del manejo animal y su mejoramiento a través del tiempo, con la finalidad de establecer si los resultados particulares son hallazgos aislados o un patrón de manejo.
Conclusiones
La implementación de prácticas de BA durante el beneficio de animales de abasto es un requerimiento legal incluido en la legislación colombiana. Desde el punto de vista ético y económico tiene implicaciones en la productividad de la cadena cárnica bovina. Se requiere el compromiso de la industria, las autoridades sanitarias, el sector académico y las instituciones de investigación, para lograr la implementación de este componente en Colombia.
El uso de los indicadores conductuales y de manejo propuestos en el presente artículo, puede mejorar el BA durante el sacrificio en las plantas de sacrificio. Estas medidas, además, pueden estandarizar los procedimientos de implementación por parte de la industria, así como las actividades de inspección, vigilancia y control de las autoridades sanitarias. Esta metodología se convierte en una herramienta sencilla y práctica de usar, respondiendo a consideraciones éticas y comerciales.
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Parámetros hematológicos de Hormigueros gigantes (Myrmecophaga tridactyla Linnaeus, 1758) de vida libre en Pore, Colombia1
ARTÍCULO DE
(Recibido: 26 de Febrero de 2014 Aprobado: 28 de Mayo de 2014 Actualizado: 19 Noviembre de 2014)
RESUMEN: Se determinaron los parámetros hematológicos de 11 hormigueros gigantes (Myrmecophaga tridactyla) capturados en vida silvestre en el municipio de Pore, Casanare, durante la época de lluvia. Los animales fueron restringidos químicamente, utilizando un coctel anestésico consistente en ketamina a dosis de 12 mg/kg y xilacina 0,5 mg/kg. Los parámetros evaluados y sus respectivos valores fueron: recuento de eritrocitos (10^6/µl) = 1,97±0,30; hematocrito (%) = 26,00±5,28; hemoglobina (mg/dl) = 11,86±1,56; amplitud de distribución eritrocitaria = 44,10±1,57; volumen corpuscular medio = 120,55±16,67; hemoglobina corpuscular media = 60,36±5,98; concentración de hemoglobina corpuscular media = 48,60±6,92; leucocitos(10^3/µl) = 10,62±5,23; neutrófilos (%) = 64,8±16,05; linfocitos (%) = 23,1±7,63; eosinófilos (%) = 9,20±7,78; monocitos(%) = 1,98±2,95; basófilos (%) = 1,40±3,27; y plaquetas (U/L) = 129080±51572,79. La media de la mayoría de los parámetros evaluados es similar a la documentada por otros autores. No obstante, se encontraron valores inferiores a lo reportado en cuanto a recuento de eritrocitos, hematocrito y hemoglobina. De igual forma, se encontró un valor de neutrófilos absolutos superior a los registrados en cautiverio y vida silvestre. Este es el primer reporte sobre parámetros hematológicos de hormigueros gigantes en vida libre en Colombia. Los valores obtenidos pueden ser útiles para la interpretación de hemogramas de individuos libres y en cautiverio, y como base para estudios de salud de hormigueros dentro de programas de conservación. Nuevos estudios con tamaños muestrales más representativos deberán determinar si las variaciones encontradas se deben a características particulares de la población objeto o a fluctuaciones normales de la especie en vida silvestre.
Palabras clave: Casanare, eritrocitos, hemograma, leucocitos, Vermilingua
Hematological parameters of free living giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla Linnaeus, 1758) in Pore, Colombia
ABSTRACT: Hematologic parameters of 11 wild giant anteaters (Myrmecophaga tridactyla) caught in the wild in Pore, Casanare, during the rainy season were determined. The animals were chemically restrained using an anesthetic cocktail consisting of ketamine at a 12 mg/kg dose and xylazine 0.5 mg/kg. The parameters evaluated and their respective values were: erythrocytes count (10^6/u) = 1.97±0.30; hematocrit (%) = 26.00±5.28; hemoglobin (mg/dl) = 11.86±1.56; red blood cell distribution width (10^3/u) = 44.10±1.57; mean corpuscular volume = 120.55±16.67; mean corpuscular hemoglobin = 60.36±5.98; mean corpuscular hemoglobin concentration = 48.60±6.92; leukocytes = 10628.00±5236.85; neutrophils (%) = 64.8±16.05; lymphocytes (%) = 23.1±7.63; eosinophils (%) = 9.20±7.78; monocytes(%) = 1.98±2.95; basophils (%) = 1.40±3.27; and platelets (U/L) = 129080±51572.79. The mean for most of the evaluated parameters is similar to that reported by other authors. However, lower values than those reported in terms of erythrocyte count, hematocrit and hemoglobin were found. Similarly, a higher absolute neutrophils value than those reported in captive and free ranging animals was found. This is the first report on hematological parameters in giant anteaters in the wild in Colombia. The values obtained may be useful for the interpretation of blood counts on captive and free ranging individuals, and as a basis for health studies in giant anteater’s conservation programs. Further studies with more representative sample sizes must determine whether the variations found are due to particular characteristics of the target population or to normal fluctuations of the species in the wild.
Key words: Casanare, erythrocytes, hemogram, leukocytes, Vermilingua
Introducción
El hormiguero gigante (Myrmecophaga tridactyla) es uno de los mamíferos más característicos de Suramérica por su gran tamaño y su cola en forma de penacho (Rodríguez-Mahecha et al., 2006). La longitud cabeza cuerpo es de 1 a 1,9 m, y posee una cola larga que alcanza entre 60 y 90 cm, no prensil y de pelo muy largo. Su peso varía entre 22 y 39 kg, pudiendo alcanzar hasta los 45 kg de peso (Wetzel, 1985; Reis et al., 2006; Miranda, 2008). Su distribución histórica va desde Guatemala hasta el norte de Argentina (Parera, 2002). Esta especie se distribuye aparentemente en gran parte de Colombia, siendo posible encontrarla en toda la Orinoquía, el Caribe, la Amazonía, y algunos departamentos de la región Andina y Pacífica (Alberico et al., 2000; Cuartas-Calle & Muñoz-Arango, 2003; Ramírez-Chaves & Noguera-Urbano, 2010; Humanez & Chacón, 2013; Ramírez-Chaves et al., 2013; Rojano et al., 2013; Solari et al., 2013). En todo su rango de distribución, se encuentra en diferentes ecosistemas como la Amazonía, la Catinga, el Cerrado, la Mata Atlántica, el Pantanal y el Chaco, entre otros (Fonseca et al., 1996; Rodríguez-Mahecha et al., 2006; Noss et al., 2008). Son activos tanto en la noche como en el día dependiendo de la temperatura, la lluvia y las perturbaciones humanas. Son terrestres y solitarios excepto durante la estación de apareamiento (Reid, 1997).
El oso hormiguero gigante se encuentra categorizado como Vulnerable a nivel nacional por su rápida disminución poblacional en los últimos 10 años por causa de la destrucción del hábitat, los atropellamientos en carreteras y la caza, entre otros (Rodríguez-Mahecha et al., 2006; Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial, 2010). Sin embargo, no se cuenta con suficiente información sobre algunas posibles amenazas, como por ejemplo el efecto del contacto con el ganado y otra fauna doméstica sobre la salud de las poblaciones silvestres de esta especie (Rodríguez-Mahecha et al., 2006). El papel de las enfermedades constituye un punto importante en las estrategias para la conservación de esta especie, dado que estas actúan como un mecanismo regulatorio de las poblaciones naturales (Miranda, 2008). No obstante, en Colombia no se han reportado trabajos que aporten al conocimiento de la salud de los hormigueros gigantes silvestres, incluyendo patrones hematológicos y fisiológicos que permitan que los investigadores interesados puedan tener datos de referencia para determinar las posibles patologías que afectan a esta especie o hacer otras pesquisas que requieran la manipulación de individuos en su medio.
Una de las herramientas con las que se cuenta es el hemograma, el cual es el principal examen de evaluación del estado de salud de individuos, debido a su facilidad, economía y utilidad en la práctica clínica. Sin embargo, aún hay una gran deficiencia en cuanto a los valores de referencia para parámetros hematológicos en animales silvestres nativos, tanto oriundos de vida libre como de cautiverio, incluyendo a M. tridactyla. Esa escasez dificulta la interpretación de los exámenes laboratoriales, pudiendo resultar en diagnósticos indeterminados o incorrectos (Sanches et al., 2012). Algunos estudios han considerado los aspectos hematológicos del hormiguero gigante (Satake, 2002; Neves et al., 2006; Vietto et al., 2008; Sanches et al., 2013) y estos pueden variar dependiendo el sexo, la edad, época del año, estado nutricional, ayuno, estado fisiológico, horario de la colecta, hidratación, altitud y hábitat (cautiverio o vida libre), entre otros (Almosny & Santos, 2001; Almosny & Monteiro, 2007). Teniendo en cuenta lo anterior, se planteó el objetivo de caracterizar los patrones hematológicos de osos hormigueros gigantes de vida libre restringidos químicamente en el municipio de Pore, Casanare, Colombia.
Materiales y Métodos
El presente estudio se desarrolló en el municipio de Pore, Casanare, en las veredas San Rafael y Cafifíes, durante los meses de noviembre y diciembre de 2013, correspondiente al final de la época de lluvia y principio de la época seca. El municipio de Pore está ubicado en la provincia fisiográfica del Orinoco y geográficamente se localiza en la zona norte del departamento del Casanare. La región presenta una temperatura promedio de 27ºC. La humedad relativa se encuentra en valores de 85 a 60% dependiendo de la época. El ecosistema predominante es la sabana inundable y la precipitación anual varía entre los 1200 y 2800 mm (Correa et al., 2006), el periodo de lluvias comprende los meses de abril a noviembre, con mayor precipitación en mayo y julio, y la estación seca va desde diciembre a marzo; la temperatura oscila entre los 26 y 27°C (Rangel et al., 1995).
En el área de estudio se seleccionaron dos fincas por cada vereda dependiendo de la disponibilidad de los propietarios. El tamaño de la muestra fue estimado por conveniencia, en total 11 capturas de individuos adultos de la especie M. tridactyla. El local de captura fue geoposicionado con GPS Garmin® Etrex 20 y son presentados en la Figura 2. Se utilizaron los protocolos de captura propuestos por Miranda (2008), realizando la búsqueda de los animales a caballo, para posteriormente enlazarlos y aplicar, con ayuda de cerbatana, un dardo que contenía un coctel anestésico consistente en ketamina a dosis de 12 mg/kg y xilacina 0,5 mg/kg (Figura 1). Dado que no se contaba con un pesaje previo del individuo, se calculó un peso promedio de 30 kg, que requirió una dosis extra en animales de mayor peso para llevarlos a un plano de sedación. Se realizó monitoreo de las constantes fisiológicas (temperatura, saturación de oxígeno y pulso) con un medidor de multiparámetros Mediaid Inc. 5340V®. Se obtuvieron hasta 10 ml de sangre, correspondiente al 0,003% del peso vivo promedio de cada individuo, a través de punción de la vena safena o braquial, con el uso de tubos al vacío (vacutainers®). Cada muestra, luego de ser colectada, fue mantenida en tubos con EDTA y conservada en refrigerante (8-12ºC) por un tiempo máximo de 24 horas. Se evaluaron los patrones hematológicos correspondientes a: recuento de eritrocitos (RGR; 10^6/µl), hematocrito (Hto; %), hemoglobina (HB; mg/dl), amplitud de distribución eritrocitaria (RDW; 10^3/µl), volumen corpuscular medio (VCM), hemoglobina corpuscular media (HCM), concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM), Leucocitos (RGB; 10^3/µl), Neutrófilos (Neu; %;10^3/µl), Linfocitos (Lin; %; 10^3/µl), Eosinófilos (Eos; %; 10^3/µl), Monocitos (Mon; %; 10^3/µl), Basófilos (Bas; %; 10^3/µl) y Plaquetas (Pla; U/L).
Se realizó conteo manual de eritrocitos y leucocitos. Para el recuento de eritrocitos su utilizó una pipeta de Thomas, con una dilución en solución salina de 1:200. El conteo se realizó en una cámara Neubauer, contando todos los eritrocitos en cinco de los 25 cuadros pequeños del área central (Kraft, 1998). Para la determinación del hematocrito se utilizaron tubos capilares lisos que fueron centrifugados a 1200 rpm durante cinco minutos y se midió directamente en la tabla de lectura con escala doble (Kraft, 1998). El análisis de la hemoglobina se realizó por la técnica de cianometahemoglobina con reactivo de Drabkin y leída en un espectrofotómetro Hitachi 4020 (Roche Diagnostics GmbH). El cálculo de la amplitud de distribución eritrocitaria se realizó con ayuda de autoanalizador Horiba Abx Micros ESV60®. Los índices eritrocitarios como VCM, HCM y CHCM fueron calculados con las fórmulas propuestas por Lee et al. (1995). Para el recuento de leucocitos se utilizó una pipeta de dilución con solución de Natt y Herrick que incorpora violeta de metilo; se utilizó una cámara de Neubauer y se realizó el conteo al microscopio de luz en objetivo de 100X marca Carl Zeiss, Axiostar Plus, en las cuatro cuadrículas grandes (Kraft, 1998). Para el reconocimiento y diferenciación de leucocitos celular se utilizó tinción de Wright, para determinar el porcentaje de linfocitos, eosinófilos, basófilos y monocitos. Las lecturas se hicieron al microscopio de luz en aumento de 100X, utilizando aceite de inmersión, iniciando por la cola del frotis y haciendo desplazamientos sigmoideos a lo largo de la lámina para realizar los conteos porcentuales con un tabulador manual (Kraft, 1998).
El análisis estadístico se realizó por medio del cálculo del intervalo de confianza para los diferentes parámetros evaluados del grupo de individuos muestreados, utilizando el programa InfoStat® versión estudiantil.
Aspectos éticos: La obtención de los muestras se realizó bajo estricta vigilancia del médico veterinario y acorde con las condiciones del sitio y manteniendo las normas de bioseguridad y bienestar animal establecidas para tal fin. Se tuvo en cuenta la Resolución No. 008430 de 1993 (4 de octubre de 1993, artículo 87, literales c, g y h) del Ministerio de Salud de Colombia. Se cumplió con los requisitos de la legislación sobre la investigación científica en diversidad biológica, que involucra alguna o todas las actividades de recolección, captura, caza, pesca, manipulación del recurso biológico y su manipulación en el territorio nacional. Se solicitó y obtuvo el permiso de la Corporación Autónoma de la Orinoquía (Corporinoquia), en el departamento del Casanare, de donde se tomaron las muestras correspondientes, de conformidad con el Decreto 309, artículo 2A de 2000 del Ministerio de Medio Ambiente y Desarrollo Sostenible de Colombia. Los investigadores de este estudio conocen los “principios éticos de la experimentación animal” enunciados por el International Council for Laboratory Animal Science (ICLAS).
Resultados y Discusión
Se muestrearon 5 machos y 6 hembras, en edad adulta y sin crías (Tabla 1). En la Tabla 2 se presentan los resultados obtenidos de los 11 hemogramas realizados. No se consideraron diferencias entre géneros y edades debido al número limitado de individuos muestreados.
Dada la escasez de datos sobre estos parámetros en Colombia, se compararon los datos con los reportados por otros autores en otros países de Suramérica para M. tridactyla. La media de casi todos los parámetros evaluados es similar a la encontrada en todos los estudios anteriores. Se resalta la diferencia encontrada en los valores relacionados con los eritrocitos, siendo inferiores en este estudio el recuento de eritrocitos, el hematocrito y la hemoglobina a los reportados por diversos autores (Satake, 2002; Neves et al., 2006; Vietto et al., 2008; Sanches et al., 2013). Diversos factores pueden influir para que haya una reducción de estos valores en mamíferos. Uno de los principales es la presencia de parásitos. Es preciso resaltar que en los individuos capturados en vida silvestre en Pore se encontraron endoparásitos, principalmente de los géneros Ascaris, Taenia y Coccidia en heces, y Babesia en sangre, al igual que garrapatas del género Amblyomma (Cunaguaro, 2014), los cuales podrían ser los causantes de los valores sanguíneos inferiores de la línea eritrocitaria. Los endo y ectoparásitos afectan a sus huéspedes, principalmente porque algunos se alimentan de sus tejidos sanguíneos para poder desarrollarse y dado al amplio rango de agentes patógenos que pueden transmitir (Allan, 2001). Otra explicación al encontrarse valores inferiores en la línea eritrocitaria es el uso de anestésicos, debido a que pueden reducir el número de eritrocitos circulantes por causa de la reducción de la presión sanguínea y al secuestro esplénico (Bennett et al., 1992; Satake, 2002). Sin embargo, tanto en este estudio como en los anteriores se utilizaron anestésicos para la obtención de muestras sanguíneas, obteniendo resultados diferentes. En mamíferos, diversos autores han documentado el efecto de los anestésicos inyectables sobre algunos parámetros hematológicos, encontrando que una única aplicación de ketamina no produce efectos sobre el recuento eritrocitario, la hemoglobina y el hematocrito de Macaca mulatta en cautiverio (Lugo-Roman et al., 2010) y que aumenta ligeramente estos mismos parámetros en Macaca fascicularis en cautiverio (Kim et al., 2005); por su parte, la combinación ketamina/xilacina no afectó significativamente los valores de eritrocitos y hemoglobina en animales domésticos como perros de raza Greyhound (Çamkerten et al., 2013) y ovejas domésticas (Ismail et al., 2010). No obstante, se ha reportado que el uso continuo de ketamina por más de dos días produce alteración del recuento de eritrocitos (RGR), el hematocrito y la hemoglobina, debido a los efectos residuales (Lugo-Roman et al., 2010). Para el muestreo de los hormigueros gigantes en vida libre en este estudio solo se hizo necesaria una aplicación de ketamina-xilacina, por lo que es probable que el suministro de estos fármacos no haya reducido considerablemente los valores de la línea eritrocitaria. Sin embargo, se hace necesario obtener nuevos datos en osos hormigueros gigantes, que permitan esclarecer este aspecto.
Algunos factores extrínsecos pueden interferir en los valores hematológicos, como el ejercicio físico. Se ha reportado que las muestras colectadas inmediatamente después de actividad tienden a presentar un hematocrito elevado (Santos & Cubas, 2007). Si bien todos los animales de este estudio fueron capturados luego de un periodo de ejercitación producto de la captura, los valores obtenidos fueron inferiores a los reportados en trabajos anteriores. La hemólisis también puede llevar a una disminución en el conteo de eritrocitos (Santos & Cubas, 2007), por lo que deberá ser tenida en cuenta en futuras pesquisas.
Se encontró un valor absoluto de neutrófilos superior a los reportados en cautiverio (Satake, 2002; Sanches et al., 2013) y en vida libre (Neves et al., 2006) para esta especie. Un aumento de neutrófilos en sangre periférica de mamíferos puede ser indicativo de infecciones, inflamaciones, flujo sanguíneo acelerado o estrés (Lander et al., 2003; Santos & Cubas, 2007). Los animales restringidos químicamente para este estudio no presentaron heridas ni infecciones aparentes durante la valoración clínica, por lo que probablemente los valores de neutrófilos superiores a los reportados en la literatura estén relacionados con el estrés generado por el proceso de captura. La captura y muestreo de individuos de vida libre normalmente genera estrés, con la consiguiente liberación de catecolaminas, conduciendo a un aumento de la liberación de los neutrófilos, y a su vez a la presentación de un leucograma de estrés, caracterizado por neutrofilia, la cual no es documentada frecuentemente en animales cautivos dado que se encuentran acostumbrados a la presencia humana y a la manipulación (Superina & Mera y Sierra, 2008). Los valores de linfocitos, eosinófilos, basófilos y monocitos son similares a los reportados para M. tridactyla por otros autores (Satake, 2002; Neves et al., 2006; Sanches et al., 2013).
Es muy la poca la información sobre hemostasia en Xenarthra. La principal función de las plaquetas es participar en el control inicial de procesos hemorrágicos. Estas células en el armadillo (Chaetophractus villosus) son ultraestructural y funcionalmente similares a otros mamíferos y al ser humano (Bermúdez et al., 2004). Los valores de plaquetas en este estudio son similares a los reportados en hormigueros gigantes por Satake (2002); no obstante, se requiere un mayor número de muestras para determinar si existen diferencias entre individuos en diferentes condiciones y estados fisiológicos. Los estudios comparativos realizados en C. villosus no determinaron diferencia entre individuos de diferente sexo, edad ni entre aquellos mantenidos en cautiverio o procedentes de vida silvestre (Bermúdez et al., 2004).
La principal limitante en estudios desarrollados en animales en vida silvestre es la posibilidad de capturar un grupo representativo de individuos que le brinden robustez a los datos, particularmente cuando se trabaja con osos hormigueros que son animales solitarios y de hábitos nocturnos, lo cual dificulta las capturas y encarece los estudios. Se requiere entonces un mayor esfuerzo de muestreo a futuro, que permita obtener más datos para así poder hacer inferencias con justificaciones estadísticas. A pesar de esto, los resultados obtenidos son de mucha importancia como punto de referencia en el estudio de la salud de esta especie en vida libre en Colombia.
Conclusión
La hematología es una herramienta esencial para el diagnóstico de salud de individuos. Este es el primer reporte sobre parámetros hematológicos en M. tridactyla en vida libre en el país. Los resultados son similares a los reportados anteriormente, con excepción de algunos parámetros eritrocitarios disminuidos y de valores de neutrófilos superiores a los reportados. Los valores obtenidos pueden ser útiles para la interpretación de hemogramas de individuos libres y en cautiverio, y como base para estudios de salud de hormigueros dentro de programas de conservación. Se deberán realizar nuevos muestreos con tamaños muestrales más representativos y en diferentes ecosistemas, que permitan realizar análisis estadísticos y así obtener valores de referencia más precisos. Nuevos estudios deberán determinar si las variaciones encontradas se deben a características particulares de la población estudiada o a fluctuaciones normales de la especie en vida silvestre.
Agradecimientos
Se agradece la financiación de este estudio a la compañía Geopark Colombia S.A.S. De igual forma se agradece la colaboración de la Universidad de Córdoba y de Ernesto Roa y María Elena López durante los procesos de captura y obtención de las muestras.
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